6株鸭源沙门氏菌的分离鉴定与药敏试验

刘 莉,董洪燕,朱善元*,张 燕,郑东宇

(1.江苏农牧科技职业学院,江苏泰州 225300;2.扬州大学兽医学院,江苏扬州 225009;3.江苏省疾病预防控制中心,江苏南京 210009)

沙门氏菌(Salmonella)是重要的食源性致病菌之一[1],可污染食品和引起食物中毒[2],其血清型超过2 500种,具有重要的公共卫生学意义。鸭源沙门氏菌病是由一种或者几种沙门氏菌(主要包括鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鸭沙门氏菌等)引起的急性或慢性疾病的总称[3]。经研究表明,鸭源沙门氏菌感染在鸭的原发性,继发性或者混合感染中也较为严重,给养鸭业带来巨大的经济损失[3]。抗菌药物在鸭细菌病防治中起重要作用,但因临床的不规范使用,造成鸭源沙门氏菌多重耐药现象的频繁发生[4],这也给鸭源细菌病的防控带来挑战,因此加强鸭源沙门氏菌耐药性监测,对临床治疗以及控制该病的流行提供依据。细菌分子分型可用于追溯不同来源或不同地区细菌分离株之间的流行病学关系,为细菌病的防控奠定基础,目前脉冲场凝胶电泳分子分型法(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)仍是国际上细菌分子分型的金标准[5]。本研究采自徐州不同养鸭场患病鸭的病料,进行细菌分离鉴定、药敏试验。旨在分析6种鸭源沙门菌的血清型、耐药性以及基因分型情况,同时建立徐州市鸭源沙门氏菌基因数据库,从而为该市的沙门氏菌病的溯源和预警提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 病料为2020年不同养鸭场的发病鸭的心脏、肝脏、肾脏等。

1.1.2 主要试剂 LB培养基、麦康凯培养基、MH培养基,陆桥公司产品;GN生化鉴定卡,法国梅里埃公司产品;2×ESTaqMaster Mix,北京康为世纪公司产品;DNA Marker、XbaⅠ,TaKaRa公司产品;沙门氏菌诊断血清,泰国S&A公司产品;药敏纸片,杭州微生物试剂有限公司产品;Sodium Lauroyl Sarcosine、SDS、蛋白酶K,Amresco公司产品;SeaKem Gold Agarose琼脂糖,Lonza公司产品;5×TBE、Tris-cl、EDTA,索莱宝公司产品;GelRed染剂,Biotium公司产品。

1.1.3 主要仪器设备 PCR仪、琼脂糖水平电泳仪、CHEF Mapper电泳仪以及凝胶成像系统,美国Bio-Rad公司产品;比浊仪、VITEK 2 COMPACT全自动微生物鉴定系统,法国梅里埃公司产品;高速冷冻离心机,德国Eppendorf公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离鉴定 用接种环无菌采取患病鸭心脏、肝脏、肾脏等病料划线接种于麦康凯鉴别培养基中,37℃培养24 h观察菌落形态,再挑取疑似菌株分别转接于TSB培养基,37℃、180 r/min培养18 h,其鉴定的方法按吴晓君等方法进行[6],其PCR结果送擎科生物科技有限公司测序后进行序列的比对分析。

1.2.2 生化和血清学鉴定 将分离到的6株鸭源沙门氏菌运用GN生化鉴定卡经VITEK微生物生化鉴定仪进行鉴定;血清型按泰国S&A公司沙门氏菌诊断血清试剂盒相关步骤以及结果判定标准进行判定。

1.2.3 药敏试验 采用世界动物卫生组织推荐的琼脂扩散法 进行,首先选取27种药敏纸片包括氨苄西林、阿莫西林、头孢曲松、头孢拉定、头孢吡肟、链霉素、卡那霉素、丁胺卡那、庆大霉素、新霉素、大观霉素、四环素、诺氟沙星、环丙沙星、洛美沙星、氯霉素、氟苯尼考、红霉素、阿奇霉素、复方新诺明、磺胺异噁唑、多黏菌素B、克林霉素、利福平和甲氧苄氨嘧啶,再将分离株新鲜菌液涂布于MH琼脂平板,用无菌镊子将药敏片贴于培养基表面,37℃培养24 h,同时设大肠埃希菌ATCC 25922作对照,根据判定结果分为敏感株、中介(中等耐药株) 、耐药株。

1.2.4 PFGE分型 参照美国PulseNet公布的沙门氏菌PFGE标准化方案进行[7],将沙门氏菌分离株经 SeaKemGlod Agarose包埋后,运用限制性内切酶XbaⅠ酶切后进行脉冲场凝胶电泳,最后经Gelred染色成像经Bionumerics5.1软件聚类分析。

2 结果

2.1 细菌的分离鉴定

经PCR鉴定结果(图1)表明,6株分离株均扩增出250 bp的目的条带,经测序比对分析结合生化试验结果(葡萄糖、麦芽糖、甘露醇产酸产气,MR和枸橼酸盐试验为阳性,不发酵乳糖、蔗糖,吲哚和VP试验为阴性),表明共分离到6株沙门氏菌。

M.DNA标准DL 2 000; 1～6.鸭源沙门氏菌分离菌株

2.2 血清学鉴定

6株鸭源沙门氏菌分离株经血清型鉴定,结果表明3株为鼠伤寒沙门氏菌,占50%;剩余3株分别为切彻斯沙门氏菌(16.67%)、图莫迪沙门氏菌(16.67%)、格洛斯特沙门氏菌(16.67%)。

2.3 药敏试验结果

6株鸭源沙门氏菌运用21种常用抗菌药物药敏试验结果(表1)显示,6株鸭源沙门氏菌对克林霉素耐药性最高,为100%,其次是头孢吡肟、头孢拉定、庆大霉素、红霉素、复方新诺明、多黏菌素B,为66.67%;对甲氧苄氨嘧啶最敏感,达100%,其次是氯霉素、四环素,达83.33%。

表1 6株鸭源沙门氏菌分离株对不同药物的敏感性比例

6株鸭源沙门氏菌分离株都具有多重耐药性(图2),最高达18种抗菌药物耐药,多重耐药性达5重及以上的,占100%。

图2 鸭源沙门氏菌多重耐药性图

2.4 鸭源沙门氏菌PFGE分型

6株鸭源沙门菌的 PFGE 图谱经 Bionumerics5.1 软件分析表明(图3),共6种带型,相似度达 53.8% 以上。3株鼠伤寒沙门氏菌(2020XZ-1SM、2020XZ-2SM、2020XZ-3SM)共有3种带型,相似度达53.8%,其中2020XZ-2SM和2020XZ-3SM相似度达78.3%;而3种不同血清型的分离株相似度达62.9%,其中2020XZ-4SM和2020XZ-6SM相似度达76.9%。

3 讨论

沙门氏菌是重要的人畜共患病病原之一。携带沙门氏菌的动物性食品包括肉、蛋类等也是沙门氏菌传播的重要传染源,鸭肉具有低脂肪和高蛋白的特点,更有利于沙门氏菌的存在[8];同时鸭独特的生活特性使其更容易成为隐性带菌者[1],因此,加强鸭源沙门氏菌病的研究具有重要意义。本研究通过PCR鉴定结合生化试验,确定共分离到6株鸭源沙门氏菌。血清学试验表明6株沙门氏菌分离株的优势血清型为鼠伤寒沙门氏菌,这与其他地区不同[9],具有区域性。

沙门氏菌病在临床治疗时,因使用抗菌药物的广泛使用以及滥用导致其耐药性特别是多重耐药性在世界范围内暴发并扩散,给全球公共卫生带来了巨大威胁[10]。研究发现河南与浙江地区沙门氏菌分离株对头孢哌酮、四环素、诺氟沙星、吡哌酸、甲氧苄氨嘧啶耐药率高[11];对四川遂宁某鸭场分离的沙门氏菌进行耐药性试验表明,4 株沙门氏菌分离株对四环素、复方新诺明、阿莫西林耐药性最高[2];对云南不同地区鸭源沙门氏菌分离株研究表明,其对林可霉素、青霉素、土霉素、强力霉素、红霉素、罗红霉素耐药[12]。本研究6株鸭源沙门氏菌分离株主要对林可酰胺类(克林霉素)耐药性最高,其次是对头孢类(头孢吡肟、头孢拉定)、氨基糖苷类(庆大霉素)、大环内酯类(红霉素)、磺胺类(复方新诺明)以及多肽类(多黏菌素B),同时多重耐药性严重,达100%;对甲氧苄氨嘧啶、氯霉素、四环素较敏感。因此,各地区耐药谱和多重耐药性情况都存在差异,这跟各地药物选择、药物使用频率和药物使用合理度都有关,通过药敏试验选择合适的抗菌药物仍是治疗鸭源沙门氏菌的最佳选择。

PFGE是一种非常有效的细菌分子分型的方法,可用于分析不同来源或不同地区菌株之间的遗传多样性,从而发现暴发、识别传染源(污染源)及推测流行范围[13]。对厦门139株不同来源的沙门氏菌进行分子分型表明优势带型为PT51,包含的菌株均为肠炎沙门氏菌带型[14];对90株人源沙门氏菌进行PFGE分型发现以鼠伤寒沙门氏菌以及肠炎沙门氏菌的带型为主[15]。本研究的6株鸭源沙门氏菌分离株共6种带型,基因型成多样性,相似度大于50%,具有流行相关性,但目前未有暴发流行株,这可能与本研究分离的菌株较少,未得出该地区的鸭源沙门氏菌的流行趋势有关,试验也将继续收集鸭源沙门氏菌,努力丰富该地区的鸭源沙门氏菌数据库,争取为鸭源沙门氏菌的防控提供更多依据。