宠物猫耳螨感染情况调查与药物治疗试验

何 冉,石 磊,杨光友

(四川农业大学,四川成都 611130)

猫耳痒螨病是由痒螨科耳螨属(Otodectes)的螨虫寄生在猫耳道内而引起的寄生性耳病,寄生于宿主的皮肤表面,以宿主脱落的上皮细胞和组织液为生,是猫的主要体外寄生虫之一。该病主要通过直接接触和间接接触感染,也是引起外耳炎的主要原因[1]。耳痒螨在耳道内的活动会引起严重的机械刺激,最常见的临床症状是明显的瘙痒,患病猫会有经常搔耳朵和摇头的动作。耳道内耳痒螨活动到体表的话,患病猫会表现轻度至重度皮炎,而强烈的瘙痒可能导致自残、出血和耳血肿等现象[2]。耳痒螨感染偶尔造成强烈的刺激和继发性细菌感染,从而导致患病动物发生化脓性外耳炎,严重影响猫的健康。目前对于耳痒螨病流行病学的调查较少[3],国内尚无针对猫耳痒螨病感染情况的相关报道,本文对四川成都某猫舍耳痒螨病的感染情况进行了调查分析,同时对采集的耳痒螨样品的细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因(COX1)和核糖体基因第2间隔区(ITS2)基因进行扩增和测序。最后采用大宠爱和海乐妙对该猫舍中患猫进行治疗效果观察。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 四川成都某猫舍的145只不同品种和不同年龄的猫。

1.1.2 虫体样品 收集形态学鉴定为耳痒螨的螨虫于1.5 mL离心管中,置于-80℃保存。

1.1.3 主要试剂与仪器 DNA提取试剂盒和PCR相关试剂,北京索莱宝科技有限公司产品;高速冷冻离心机、PCR仪,德国Eppendorf公司产品;核酸凝胶电泳仪、凝胶成像系统,美国Bio-Rad公司产品;体视显微镜,日本Nikon公司产品;恒温培养箱,美国Thermo公司产品。

1.2 方法

1.2.1 临床诊断和病原检查 宠物猫表现摇头抓耳,外耳道有大量黑褐色分泌物以及耳道内常散发出异味可初步判定为耳螨病疑似病例。刮取疑似病例耳道中黑褐色分泌物,放置于培养皿中,在36℃恒温培养箱中孵育30 min后在显微镜下观察,挑取单个螨虫进行形态学鉴定,同时逐一记录病例的性别、品种和年龄等相关的信息。

1.2.2 形态学特征鉴定 参考相关文献进行形态学鉴定[4]。

1.2.3 样品DNA提取 研磨收集到的螨虫,按照基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA,并置于-20℃冰箱保存备用。

1.2.4 PCR扩增 扩增COX1目的引物序列为:上游引物5′-GGTATTTGAAGAGGAATGTTGG-3′和下游引物5′-GATGACCAAAAAACCAAA ATAAATG-3′,扩增ITS2目的引物序列为:上游引物5′-CTCCGATCACTCGACATTC-3′和下游引物5′-ATCTCGCTTGATCTGAGGTCG-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR 扩增体系(总体积为 25 μL):2×TaqMaster Mix(Dye Plus)12.5 μL,上、下游引物各0.5 μL,模板DNA 1 μL,ddH2O 10.5 μL。PCR扩增程序:94℃预变性3 min;94℃ 1 min,54.4℃或57.5℃(COX1或ITS2) 1 min,72℃ 1 min,共35个循环;72℃再延伸7 min。PCR产物由10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.5 COX1和ITS2序列测定及分析 将PCR阳性产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序,利用DNAMan软件对测序结果和NCBI上传的耳痒螨COX1和ITS2序列进行比对分析。

1.2.6 药物治疗 从患病猫中筛选出30只确诊病例随机平均分成3组,分别为海乐妙(米尔贝肟16 mg和吡喹酮40 mg)试验组,以3 mg/kg为剂量口服1次进行治疗;大宠爱(塞拉菌素45 mg)试验组,以6 mg/kg为剂量滴于猫咪两肩胛骨之间的皮肤1次进行治疗;空白对照组,不采取任何治疗措施。

1.2.7 效果评估 治疗前和治疗后7 d,对每只猫的双耳进行检查,对每个耳朵中可见的活螨数量进行计数,判定感染强度。用棉棒采集耳垢放入玻璃平皿中,置于36℃培养箱中培养大约30 min,取出后在体视显微镜下对螨虫进行计数。

螨虫数量统计方法为:在体视显微镜下随机选取5个视野,若每个视野中螨虫计数不超过10,则记为“+”。若任意视野中螨虫数量大于10,则记为“++”。若均未发现虫体,则记为0。耳道内耳垢量的判定标准为:无耳垢(0),轻微耳垢(+),中度耳垢(++)和严重耳垢(+++)。在药物治疗7 d后,用相同的方法收集耳垢并统计螨虫数量和耳垢量。

2 结果

2.1 临床症状观察

患猫主要表现为瘙痒,摇头抓耳,外耳道有大量黑褐色分泌物(图1)。少量患猫因瘙痒用爪部对耳周进行抓挠,导致耳朵后部或基部形成开放性结痂皮肤伤口。该病主要发病于耳道内,少数患病猫会造成全身性的病变。

图1 患猫外耳道有大量黑褐色分泌物

2.2 虫体形态学观察

犬耳痒螨(Otodectescynotis)形态学特征主要区别在于第1对足和第2对足具有短柄的前跗,第3对足和第4对足的末端具有鞭状刚毛,第4对足相对更短,生殖器为横切开口。本试验采集样品经过形态学鉴定为犬耳痒螨(Otodectescynotis)(图2)。

图2 犬耳痒螨形态

2.3 分子鉴定

琼脂凝胶电泳检测结果显示扩增的7个样品的COX1序列大小均为600 bp左右(图3),10个样品的ITS2序列大小均为300 bp左右(图4),与预期结果相符。测序结果显示获得的COX1和ITS2序列长度分别为655 bp和324 bp。其中7个样品COX1序列与GenBank公布的犬耳痒螨(Otodectescynotis)COX1中国西安株同源性为99.08%～100%,10个样品的ITS2序列和犬耳痒螨德国慕尼黑株ITS2 (AF367699)序列相似性为99.69%～100%,从分子水平确定本试验中扩增的螨虫是犬耳痒螨(Otodectescynotis)。

M.DNA标准DL 2 000; 1～7.COX1-1～COX1-7M.DNA Marker DL 2 000; 1-7.COX1-1～COX1-7

M.DNA标准DL 2 000;1-10.ITS2-1～ITS2-10M.DNA Marker DL 2 000; 1-10.ITS2-1-ITS2-10

2.4 耳痒螨感染情况

经过临床诊断和病原学鉴定,该猫舍确诊耳痒螨感染的猫81例,耳螨病阳性率为55.9%。分别统计了不同性别猫的耳痒螨病感染情况,发现公猫患耳痒螨病的阳性率为40.0%(18/45),母猫患耳痒螨病的阳性率为60.0%(60/100)。同时,根据确诊结果发现幼龄的猫更易感染耳痒螨,其中2～4月龄的猫感染率为64.3%(9/14),12～24月龄的猫感染率为54.9%(72/131)。

该猫舍的拥有7个品种的猫,通过临床诊断和病原学鉴定发现,加菲猫的感染率最高,其次分别为暹罗猫、美国短毛猫、英国短毛猫和豹猫,布偶猫和德国卷毛猫无感染病例(表1)。

表1 不同品种猫的耳痒螨感染情况

2.5 效果评价

大宠爱治疗后,该试验组猫耳道内均未发现耳痒螨(表2)。而海乐妙试验组及空白对照组猫耳道内耳螨数量无明显变化。同时,空白对照组猫耳道内耳垢出现增多的情况,而大宠爱和海乐妙治疗的患猫均有耳垢量均减少(表3)。

表2 猫治疗前后耳痒螨感染强度的变化情况

表3 猫治疗前后耳道内耳垢量的变化情况

3 讨论

犬耳痒螨通过与受感染的动物直接接触传染,具有高度传染性,可以感染多种动物,例如犬、猫、狐狸和雪貂,偶尔还会感染人[5]。我国针对犬和猫耳痒螨病的流行病学调查报道较少,更多为针对犬螨病的调查研究。中国宠物行业白皮书数据显示,2020我国城镇宠物犬猫数量突破1亿只,其中宠物猫的数量在逐年上升,仅2020年就增加了10.2%,数量接近5 000万只。随着宠物猫数量的增多,宠物猫的健康也成为人们关注的重点。耳痒螨是猫的主要体外寄生虫之一,也是引起外耳炎的主要原因[4],调查发现50%～80%的猫外耳炎病例由耳痒螨螨虫引起[6]。

目前国内外对于猫耳螨病的流行病学调查报道较少,仅限于少数地区。例如欧洲南部和中部的7个国家1 519只宠物猫的耳螨病阳性率为17.4%[3],在希腊则有25.5%的宠物猫被诊断为耳螨病阳性[7],另外意大利北部187只流浪猫的调查中发现53.3%外耳炎由耳螨病引起[6]。国内尚无猫耳痒螨病感染情况的报道,有部分关于分子生物学的研究[14]。国内外主要研究是对猫耳螨病药物治疗的研究[8-10]。本文对四川省成都市某猫舍耳螨病进行调查发现,该猫舍耳螨病阳性率高达55.9%,远远超过了国外类似的调查。国外调查对象多为家猫,而本文调查对象为猫舍,在饲养环境上猫舍的猫更为密集,存在交叉感染的情况,导致调查结果阳性率偏高。同时,由于猫舍母猫的数量远远超过了公猫的数量,也为母猫阳性率高于公猫阳性率提供了数据基础。其中加菲猫的阳性率在不同品种的猫中最高,主要是由于该猫舍加菲猫均饲养在相邻的笼舍,并且共用饮水器和食槽,为加菲猫之间的相互传染提供了可能。幼猫更容易感染耳螨病则主要原因是幼猫的免疫力较成年猫低。

虽然国外报道伊维菌素、多拉菌素和莫西菌素等药物在防治猫耳螨病上效果显著[11-12],但是国内猫品种多,数量大,饲养环境复杂,宠主依从性差,科学的选择合适我国治疗猫耳螨病的药物显得尤为重要。目前我国对于宠物耳螨病的治疗,使用的药物包括注射药剂,体外驱虫剂和体内驱虫药。其中,伊维菌素和多拉菌素为注射剂,使用需要专业人员操作。美贝霉素为口服或浇泼给药,对部分体内寄生虫和体外寄生虫有很好的效果[21]。国外的大宠爱对姬螯螨[13]、疥螨[14]、背肛螨[15]、跳蚤[16]、线虫[17]等体内外寄生虫都有良好的驱杀效果,国内新药海乐妙对犬蠕形螨[18]、疥螨[19]、姬螯螨[20]、犬恶心丝虫[21]、钩虫[22]、蛔虫[23]、眼线虫[24]等体内外寄生虫都有良好的驱杀效果。本文以海乐妙和大宠爱进行对照治疗,发现以6 mg/kg的剂量使用大宠爱滴于猫咪颈后两肩胛骨之间的皮肤1次进行猫耳痒螨病的治疗,7 d后就杀螨成功率能达到100%,而以3 mg/kg的剂量口服1次海乐妙治疗猫耳痒螨病,7 d后就杀螨成功率只有10%。大宠爱的主要成分是塞拉菌素,海乐妙主要成分是米尔贝肟,塞拉菌素和米尔贝肟都属于大环内酯类抗生素,塞拉菌素是由基因重组的阿维链霉菌新菌株发酵而成,米尔贝肟则是米尔贝霉素A3和A4的衍生物[25]。通过结果可以看出在以上试验条件下,大宠爱的驱杀效果要优于海乐妙。本次对比治疗观察时间较短,今后增加海乐妙的用药剂量或用药次数,进一步观察其猫耳螨的驱杀效果。