自体浓缩生长因子凝胶治疗肛瘘的疗效及作用机制研究

张秀峰 王厚东 裘建明 鲁振锋 邵书先 沈忠

肛瘘是肛肠科常见病，可发生于任何年龄段人群，多见于青壮年。肛瘘急性期表现为肛周肿痛、破溃流脓，且具有反复发作的特点，严重影响患者生活。目前临床上治疗肛瘘的主要方式是外科手术，经典术式为肛瘘切开术和切除术，但术后切口愈合较慢、疼痛明显且持续时间长、住院时间长、复发率较高，同时手术会损伤肛门括约肌，有发生肛门功能减退，甚至肛门失禁的风险。自体浓缩生长因子（concentrated growth factor，CGF）是通过离心的方法从自体外周静脉血中提取的、含有高浓度生长因子的产物，具有加速伤口愈合的功效。本研究对CGF 凝胶治疗肛瘘的效果及作用机制作一探讨，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器 血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）抗体（批号：AF0240）、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗体（批号：AF0239）、α 平滑肌肌动蛋白（alpha smooth muscle actin，α-SMA）抗体（批号：AF1032）、cfos 抗体（批号：AF5354）均购自美国Affinity 公司；LipofectamineTM3000 转染试剂（批号：L3000075）购自美国Thermo Fisher 公司；YF®594 Click-iT 5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶核苷（5-Ethynyl-2'-deoxyuridine，Edu）Imaging Kits 细胞增殖检测试剂盒（批号：40276ES60）购自上海翌圣生物科技股份有限公司；反转录试剂盒（批号：CW2569）购自北京康为世纪生物科技有限公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）购自江苏亲科生物研究中心有限公司；SYBR Premix Ex TaqⅡ（批号：RR820A）购自日本Takara 公司；Edu-594 细胞增殖检测试剂盒（批号：C0078s）购自上海碧云天生物技术有限公司。qRTPCR 仪购自美国Bio Rad 公司；Medifuge 离心机购自意大利Silfradent 公司；酶标仪购自美国MD 公司；Ts2-FC倒置荧光显微镜及成像系统购自日本尼康公司。

1.2 实验动物 30 kg 雄性长白猪6 只，由江苏吴江田宇生物科技有限公司[动物生产许可证号：SCXK（苏）2021-0007]提供，饲养于清洁级动物房标准笼中，予标准饲料，自由摄食、饮水。饲养条件：温度26 ℃，湿度50%，环境噪声＜60 dB。本实验经浙江中医药大学实验动物管理与伦理委员会审查通过（批准文号：IACUC-20211018-16）。

1.3 肛瘘造模 （1）依据相关文献报道的挂线法进行肛瘘造模[1]。6 只长白猪术前禁食1 d。全麻成功后取仰卧位，固定四肢；清理猪肛管内残留粪便，常规备皮、消毒及铺巾。于左侧距离肛缘约2 cm 处作一大小约0.5 cm 的切口，使用血管钳钝性分离皮下组织至齿状线上，注意避开肛门括约肌；使用血管钳尖端于齿状线上刺破直肠黏膜，钳夹引入丝线；在丝线引导下穿入橡皮筋并固定。同法在右侧对称部位及尾部做2个挂线，见图1（插页）。术后第30 天造影检查结束后切除尾部瘘管进行病理学检查，以明确瘘管是否形成；取左右两侧瘘管分成凝胶组和对照组进行动物实验。（2）术后第14 天去除橡皮筋，第30 天采用瘘管造影检查评估瘘管是否形成，见图2（插页）。全麻成功后取仰卧位，两后肢充分外展，清理下端直肠内残留粪便，轻柔置入60 mL 注射器外套筒，注意避免损伤肠黏膜；取合适的X 线摄片体位后，将对比剂自瘘管外口缓慢注入，防止外漏，边注入边摄片，观察瘘管管腔是否显影。

图1 挂线法肛瘘造模

图2 瘘管造影检查评估瘘管是否形成（A：合适的摄片体位；B：瘘管造影检查显示瘘管内及肠腔内对比剂残留；C：切取的瘘管组织）

1.4 CGF 凝胶的制备 抽取上腔静脉血10 mL，按照Medifuge 离心机操作要求选择CGF 模式进行差速离心，取上层凝胶（即CGF 凝胶），使用无菌剪刀修剪去除黏附的红细胞层，见图3（插页）。细胞活性预实验结果提示CGF 凝胶最佳浓度为20%，故细胞实验部分以20% CGF 凝胶浓度进行研究。

图3 自体浓缩生长因子凝胶的制备

1.5 动物实验

1.5.1 动物分组与处理 将每只长白猪肛门左右侧瘘管按随机数字表法分为凝胶组和对照组。全麻成功后取仰卧位，固定四肢及尾部。清理残留粪便，在肛门内置入一块洁净纱布，防止术中近端肠道粪便污染手术区域；消毒肛周、肛管及下段肠道。先以食指探查瘘管内口位置，然后将手指置于肛门中保护，在搔刮过程中避免损伤正常的肛管及肠道黏膜；使用刮匙自外口伸入瘘管，充分搔刮瘘管管壁；充分暴露内口，直视下予3-0 可吸收缝线间断缝合关闭内口；将CGF凝胶从外口处填入搔刮后的瘘管中，外口处缝合1 针，以防止凝胶脱落，见图4（插页）。对照组仅行瘘管搔刮及关闭内口。

图4 自体浓缩生长因子凝胶的使用

1.5.2 疗效观察 观察两组瘘管创面愈合情况，检测术后第7 天瘘管外口组织样本PDGF、PCNA、α-SMA、c-fos mRNA 及蛋白表达水平以及细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）信号通路因子[包括丝裂原激活蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MEK）1/2、磷酸化MEK（p-MEK）1/2、ERK1/2、磷酸化ERK（p-ERK）1/2]蛋白表达水平。（1）使用B 超检查随访瘘管创面愈合情况。（2）采用qRT-PCR 法检测各因子mRNA 表达水平。采用Trizol 裂解提取各组取瘘管外口组织总RNA，使用反转录试剂盒反转录成cDNA，以特异性引物扩增PDGF、PCNA、α-SMA、c-fos，进行qRT-PCR，以GAPDH 为内参，采用2-ΔΔCt法计算PDGF、PCNA、α-SMA、c-fos mRNA 表达水平。引物序列见表1。（3）采用Western blot 法检测各因子蛋白表达水平。取瘘管外口组织样本，提取蛋白，采用BCA 法测定蛋白浓度。蛋白变性后，使用30 μg 蛋白样品进行凝胶电泳、转膜并封闭，然后分别加入一抗（PDGF、PCNA、α-SMA、c-fos、p-MEK1/2、MEK1/2、p-ERK1/2、ERK1/2均为1∶1 000；GAPDH 为1∶5 000），在4 ℃下孵育过夜；加入羊抗兔二抗（1∶2 000，HRP 标记），室温孵育；采用增强化学发光法显色，凝胶成像、显影。利用Image J 图像分析系统进行分析，以目的条带与GAPDH的灰度比值计算目的蛋白表达水平。

表1 引物序列

1.6 细胞实验

1.6.1 细胞培养与分组 人皮肤成纤维细胞（human skin fibroblast，HSF）（批号：iCell-0051a）购自赛百慷（上海）生物技术股份有限公司。将HSF 置于含10% FBS 的DMEM 培养液中，在5% CO2、37 ℃、饱和湿度的环境下培养。调整细胞浓度，按5×105个/孔的密度接种于6 孔板中并培养24 h；然后按随机数字表法分为对照组（10%FBS）、20% CGF 组、20% CGF+小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）组、20% CGF+siRNA ERK 组。按照LipofectamineTM3000 转染试剂说明书操作，分别配制siRNA ERK 及siRNA 复合物，在对应组细胞中加入转染复合物，同时在对应组中使用20% CGF 进行干预，8 h 后收集细胞进行后续检测。

1.6.2 CGF 对HSF 细胞增殖能力的影响检测 采用免疫荧光法。配制10 μmol/L EdU 工作液并加入各组细胞中孵育4 h。95%乙醇溶液固定细胞，PBS 洗涤，TritonX-100 透化；配制Click 反应液，室温避光孵育30 min；使用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚染色2 min。使用倒置荧光显微镜进行观察、拍照，统计每个视野中的细胞总数和阳性细胞数。HSF 细胞增殖百分比=阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.7 统计学处理 采用SPSS 17.0 统计软件。计量资料以表示，两组比较采用两独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组瘘管创面愈合情况比较 凝胶组瘘管创面全部愈合，对照组有1 只假性愈合，其余创面均愈合，见图5。凝胶组创面愈合时间为（10.50±1.38）d，明显短于对照组的（17.00±1.41）d，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图5 B 超检查随访创面愈合情况（A：可见条索状愈合瘢痕组织；B：可见低回声区，提示假性愈合）

2.2 两组瘘管外口组织样本PDGF、PCNA、α-SMA、cfos mRNA 表达水平比较 凝胶组瘘管外口组织样本PDGF、PCNA、α-SMA、c-fos mRNA 表达水平均明显高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表2。

表2 两组瘘管外口组织样本PDGF、PCNA、α-SMA、c-fos mRNA表达水平比较

2.3 两组瘘管外口组织样本PDGF、PCNA、α-SMA、cfos 及ERK 信号通路因子蛋白表达水平比较 凝胶组瘘管外口组织样本PDGF、PCNA、α-SMA、C-fos 及p-MEK1/2、p-ERK1/2 蛋白水平均明显高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；两组瘘管外口组织样本MEK1/2、ERK1/2 蛋白表达水平比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），见图6 和表3～4。

表3 两组瘘管外口组织样本PDGF、PCNA、α-SMA、c-fos蛋白表达水平比较

表4 两组瘘管外口组织样本ERK信号通路因子蛋白表达水平比较

图6 两组瘘管外口组织样本PDGF、PCNA、α-SMA、c-fos 及ERK 信号通路因子蛋白表达的电泳图

2.4 干扰ERK 逆转CGF 对HSF 细胞增殖能力的影响 与对照组比较，20% CGF 组、20% CGF+siRNA 组HSF 细胞增殖百分比均明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与20% CGF+siRNA 组比较，20% CGF+siRNA ERK 组HSF 细胞增殖百分比明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图7。

图7 干扰ERK 逆转CGF 对HSF 细胞增殖能力的影响[A：免疫荧光图，×200；B：各组HSF 细胞增殖百分比比较（n=3），与对照组比较，aP＜0.05；与20% CGF+siRNA 组比较，bP＜0.05]

3 讨论

近年来，肛瘘发病率有明显增高趋势[2]。肛瘘发病时，患者肛周肿痛流脓且反复发作，会对工作和生活造成严重影响[3]。外科手术是目前治疗肛瘘的主要方式，经典术式为肛瘘切开术和肛瘘切除术，其中肛瘘切开术的复发率为3.3%～39.0%，切口愈合时间为47～67 d[4-7]；而肛瘘切除术的复发率为6.0%～23.8%，切口愈合时间为21～36 d[8-11]。可见，肛瘘术后切口愈合时间较长，患者疼痛明显且持续时间长，住院时间久，复发率较高，同时手术创伤也可能导致肛门功能减退，甚至肛门失禁等并发症。

近年来临床上涌现了一些基于生物材料填充瘘管治疗肛瘘的方法，主要包括生物胶、肛瘘栓、脱细胞基质等[12-14]。这些方法治疗肛瘘的原理是通过生物材料的修复作用促进肛瘘的愈合。但这些方法治疗肛瘘的复发率仍然较高，且生物材料价格较为昂贵，并且作为异源性物质，其组织相容性也欠佳。自体富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）是通过离心的方法从自体血液中提取获得的血小板浓缩物，含有高浓度的生长因子，具有加速伤口愈合的功效[15]。Moreno-Serrano 等[16]采用PRP 治疗23 例肛瘘患者，随访1 年发现其治愈率达62%，且无患者发生括约肌损伤。CGF是最新一代的富血小板产物，相较于PRP，其包含更丰富的生长因子[17]。本研究将CGF 凝胶填塞入搔刮后的瘘管中，结果发现凝胶组瘘管愈合时间较对照组明显缩短，且无假性愈合发生。

组织修复过程存在一个极其复杂的信号网络调控机制，各种生长因子参与创面愈合的调控，其中PDGF 是目前公认的与创面愈合关系密切的生长因子之一。PDGF 对于间充质细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞至关重要，具有促进细胞增殖和分化、刺激IL-6合成、促进新生血管形成、修复血管内膜等作用[18-20]。本研究将CGF 凝胶填塞入瘘管后发现组织样本中PDGF 蛋白表达水平明显升高，进而促进组织生长和血管生成。此外，PDGF 与ERK 在组织修复中的作用密切相关[21-22]。ERK 是丝裂原活化蛋白激酶家族成员，它的信号传递涉及细胞生长、发育及分裂的调控[23-24]，而ERK 信号通路的激活介导成纤维细胞的增殖和迁移，可促进肉芽组织生长，进而促进创面愈合[25-26]。研究发现，ERK 信号通路因子p-MEK1/2、p-ERK1/2 蛋白表达水平以及下游信号分子PCNA、α-SMA、c-fos mRNA 及蛋白表达水平均明显高于对照组，进而促进细胞增殖及血管形成。在HSF 细胞实验中进一步证实，CGF 能明显提高HSF 细胞增殖能力，而使用siRNA 干扰ERK 信号通路后，CGF 对HSF 细胞增殖能力的影响明显减弱；提示CGF 可以通过激活ERK 信号通路来提高HSF 细胞增殖能力，且这种作用可以被siRNA ERK 逆转。

综上所述，CGF 凝胶治疗肛瘘有效，其作用机制是通过上调ERK 信号通路因子水平来促进HSF 增殖，从而加速瘘管愈合。由于肛瘘术后是否治愈需要长期观察，但本研究受限于动物实验，观察时间较短，因此存在一定的局限性。今后仍需深入研究CGF 凝胶在肛瘘微创治疗中的应用价值。