TGF-β1/Smad3 信号通路调控MMP-13/TIMP-1 蛋白表达在糖尿病膀胱纤维化中的作用研究

周海永 郁建迪 闻华立 彭昆 颜俊锋 汪星

糖尿病膀胱病变（diabetic cystopathy，DCP）是糖尿病患者易发生的并发症，其发生率达40%～85%[1]。DCP 以膀胱感觉下降、逼尿肌顺应性及收缩力下降为主要临床特征，最终可导致患者排尿困难，加重泌尿系感染及肾脏损伤等[2]。膀胱纤维化是其主要病理学特征，主要表现为间质中的胶原蛋白异常沉积或分布发生变化[3]，目前尚无有效的防治方法。因此，探讨糖尿病膀胱纤维化的病理机制具有临床意义。笔者前期研究发现，老年大鼠膀胱平滑肌结构异常，Ⅰ型胶原蛋白（collagenⅠ，colⅠ）、Ⅲ型胶原蛋白（collagenⅢ，col Ⅲ）表达水平明显升高，但关于糖尿病膀胱平滑肌纤维化的发生机制目前尚不明确[4]。细胞外基质（extracellular matrix，ECM）合成与降解不平衡引起的ECM过度沉积是膀胱纤维化发展必经阶段[5]。研究发现，基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-13 能特异性作用于colⅠ、Ⅱ型胶原蛋白（collagen Ⅱ）和colⅢ，参与ECM 的降解与重构，从而促成纤维化的发生[6]。基质金属蛋白酶抑制剂（tissue inhibitor of matrix metalloproteinase，TIMP）是MMP 的内源性特异性抑制剂，两者相互作用对ECM 的稳定具有重要影响。MMP过度激活也会升高TIMP-1 水平，而两者组成的MMP-13/TIMP-1 复合物能显著抑制MMP-13 对胶原蛋白的降解作用[7]。MMP 和TIMP 是转化生长因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）/细胞信号转导分子3（signaling molecule 3，Smad3）信号通路下游信号分子，DCP 可能通过该信号通路对MMP/TIMP 引起的膀胱纤维化进行调节[8]。因此，本研究利用糖尿病大鼠膀胱组织探讨TGF-β1/Smad3 信号通路调控MMP-13/TIMP-1 蛋白表达在糖尿病膀胱纤维化中的作用，为DCP 临床治疗靶点提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器 Smad3 抗体、MMP-13 抗体、TIMP-1 抗体、colⅠ抗体、col Ⅲ抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体均购自美国Santa 公司；TGF-β1 抗体购自北京CST 公司；二抗辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的IgG 购自英国Abcam 公司；5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）购自日本Sigma公司；Western 封闭液、一抗稀释液、二抗稀释液均购自中国碧云天生物技术公司。StatFax-2100 酶标仪购自美国Awareness 公司；7500 Fast RT-PCR 仪购自美国Life techn0109ies 公司；S1000 PCR 逆转录仪、PowerPac Uhiversal 电泳仪均购自美国Bio-Rad 公司；高速低温离心机购自日本Sigma 公司；M70C 电脑型荧光显微镜购自上海万衡精密仪器有限公司。

1.2 动物分组与建模 3 月龄、健康、无特定病原体的成年雄性Wistar 大鼠100 只均购自北京维通利华实验动物中心，体重（200±10）g，饲养在温度22～26 ℃、湿度45%～75%的培养环境中。将80 只大鼠按随机数字表法分为糖尿病组和正常对照组，每组40 只；另外20 只大鼠按随机数字表法分为TGF-β1 敲除组和Smad3 敲除组，每组10 只。采用链脲佐菌素构建糖尿病大鼠模型：大鼠禁食18 h 后，按6.5 mL/kg 剂量一次性腹腔注射1%链脲佐菌素缓冲液（配置方法：将链脲佐菌素溶解于0.1 mol/L pH 4.2 的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中）。正常对照组大鼠按6.5 mL/kg 剂量一次性注射檬酸-柠檬酸钠缓冲液。2 h 后采集大鼠尾部静脉第二滴血液测定血糖水平，若检测结果显示大鼠空腹血糖＞1.67 nmol/L 则判定糖尿病大鼠模型构建成功。建模成功后，继续饲养大鼠8 周，每周监测血糖水平。TGF-β1 敲除组、Smad3 敲除组大鼠采用Cas9 gene targeting 技术分别敲除TGF-β1 或Smad3 基因，利用RTPCR 和细胞免疫荧光染色技术等评价TGF-β1 或Smad3 基因敲除效果。

1.3 大鼠膀胱组织病理学形态观察 两组大鼠8 周后通过注射3%戊巴比妥钠过量麻醉处死。将大鼠固定冰上，于耻骨上作约2 cm 的纵行切口，暴露膀胱，去除输尿管及膀胱浆膜层后取出膀胱，反复用PBS 清洗，剔除膀胱黏膜层，获得膀胱平滑肌组织。经10%甲醛固定、脱水、石蜡包埋、切片，分别经HE 或VG 染色后，在400 倍光镜下观察大鼠膀胱平滑肌结构及纤维化程度。

1.4 大鼠膀胱平滑肌组织中相关信号通路因子蛋白表达水平检测 采用Western blot 法。取两组大鼠新鲜膀胱平滑肌组织，每20 mg 样本加入150 μL 裂解液，低温研磨仪研磨，12 000 r/min 离心15 min，取上清液，提取全蛋白，根据说明书采用BCA 法进行蛋白定量。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白，采用湿转法转移至聚偏二氟乙烯膜上。5%BSA 封闭2 h，将TGF-β1、Smad3、MMP-13、TIMP-1、col Ⅰ、col Ⅲ与GAPDH 一抗（1∶400 稀释）在37 ℃下孵化1 h，然后4 ℃过夜，使用TBST 缓冲液洗膜，HRP 标记二抗（1∶4 000稀释）37 ℃下孵化1 h，洗膜，增强化学发光法显色，经曝光扫描后进行图像分析。以目的条带与GAPDH 的灰度比值计算相关信号通路因子蛋白表达水平。

1.5 统计学处理 采用SPSS 21.0 统计软件。计量资料组间比较采用两独立样本t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠膀胱组织病理学形态观察 HE 及VG 染色结果显示，糖尿病组大鼠膀胱组织胶原纤维明显增多，见图1。

图1 大鼠膀胱组织病理学形态观察（A：糖尿病组，HE 染色，×400；B：正常对照组，HE 染色，×400；C：糖尿病组，VG 染色，×400；D：正常对照组，VG 染色，×400）

2.2 两组大鼠膀胱平滑肌组织中TGF-β1、Smad3、MMP-13、TIMP-1 蛋白表达水平比较 糖尿病组大鼠膀胱平滑肌组织中TGF-β1、Smad3、MMP-13、TIMP-1蛋白表达水平均明显高于正常对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图2。

图2 两组大鼠膀胱平滑肌组织中TGF-β1、Smad3、MMP-13、TIMP-1蛋白表达水平比较（A：电泳图；B：表达水平比较，aP＜0.05）

2.3 TGF-β1 敲除对糖尿病大鼠膀胱平滑肌组织MMP-13、TIMP-1、colⅠ、col Ⅲ蛋白表达水平的影响TGF-β1 敲除组大鼠膀胱平滑肌组织中MMP-13、TIMP-1、colⅠ、col Ⅲ蛋白表达水平均明显低于糖尿病组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图3。

图3 TGF-β1 敲除对糖尿病大鼠膀胱平滑肌组织中MMP-13、TIMP-1、colⅠ、colⅢ蛋白表达水平的影响（A：电泳图；B：表达水平比较，aP＜0.05）

2.4 Smad3 敲除对糖尿病大鼠膀胱平滑肌组织中MMP-13、TIMP-1、colⅠ、col Ⅲ蛋白表达水平的影响Smad3 敲除组大鼠膀胱平滑肌组织中MMP-13、TIMP-1、colⅠ、col Ⅲ蛋白表达水平均明显低于糖尿病组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图4。

图4 Smad3 敲除对糖尿病大鼠膀胱平滑肌组织中MMP-13、TIMP-1、colⅠ、colⅢ蛋白表达水平的影响（A：电泳图；B：表达水平比较，aP＜0.05）

3 讨论

DCP 是以间质胶原的位置发生改变或异常沉积为特点的膀胱纤维化。本研究利用HE 或VG 染色观察大鼠膀胱组织病理学形态，结果发现糖尿病大鼠膀胱组织中胶原纤维明显增多，符合DCP 的病理特征。研究表明，ECM 合成与降解不平衡可导致ECM 过度沉积，从而引起膀胱纤维化，是膀胱纤维化进展的必经阶段[9-10]。MMP 作为一类重要的蛋白酶，能对ECM 中的多种组分进行特异性降解，在调控过程中会造成大量胶原蛋白聚集，最终导致纤维化。MMP-13 具有高度的特异性，能有效分解colⅠ、col Ⅱ、col Ⅲ，其降解能力较MMP-1、MMP-8 高出40 倍，在ECM 的降解、重构以及促进纤维化发生中具有重要作用。相关研究表明，MMP-13 在肝纤维化大鼠肝组织中的表达水平持续升高，同时能清楚观察到有明显的ECM 沉积，使得基质微环境稳定性变差，而这也是出现肝ECM 重构和不可逆性纤维化的关键原因，提示MMP-13 参与糖尿病肝纤维化的过程。TIMP 作为MMP 的内源性特异性抑制剂，两者交互作用对ECM 稳态的维护和修复具有重要临床意义。随着MMP 的过度激活，TIMP-1 表达也明显上调，而表达上调的TIMP-1 可与MMP-13 组成MMP-13/TIMP-1 复合物，进而抑制MMP-13 降解胶原。

TGF-β1/Smad3 信号通路是造成间质纤维化的重要途径，也是目前研究热点。不少学者将TGF-β1/Smad3 信号通路视作不可或缺的纤维化诱导因子，其对纤维化的影响主要包括以下3 点：（1）促进ECM 成分合成，使纤维细胞数量明显增加；（2）对ECM 降解的各种酶活性进行抑制，使TIMP 及纤维蛋白蛋白的活性增强，从而使得ECM 的降解受到抑制；（3）推动上皮间充质细胞向肌成纤维细胞（myofibroblast，MFB）的转变。由此推测，MMP-13/TIMP-1 可能会受到TGF-β1信号的调控。本研究采用Western blot 法检测糖尿病组与正常对照组大鼠膀胱平滑肌组织中TGF-β1、Smad3、MMP-13、TIMP-1 蛋白表达水平，结果显示糖尿病组TGF-β1、Smad3、MMP-13、TIMP-1 蛋白表达水平均明显高于正常对照组，提示MMP-13/TIMP-1 表达异常与糖尿病所致的纤维化有关，进而推测DCP 的作用机制可能与TGF-β1/Smad3 信号通路有关。

TGF-β 家族的生物学作用需要借助完整的Smad来完成[11]。其中TGF-β1 是公认的促纤维化核心因子，能启动并调节ECM 的全过程[12]。第一步是TGF-β 1 与其Ⅱ型受体相结合，而Ⅱ型受体可对Ⅰ型受体进行磷酸化，激活后的Ⅰ型受体会将Smad2、Smad3 进行活化，之后磷酸化的Smad2、Smad3 与Smad4 一同进入细胞中，在细胞核内调控TGF-β1 靶基因的转录[13]。有研究表明，TGF-β1 信号通路被激活后即可通过下游Smad 和非Smad 信号通路（如p38 MAPK 和PI3K/Akt途径）参与肾纤维化[14]。此外，李玉琴等[15]指出Smad3磷酰化的选择性抑制剂可通过抑制α-平滑肌肌动蛋白和肌成纤维细胞的积聚，从而抑制糖尿病肾病肾小管间质纤维化进程。许多衔接蛋白能将Smad2、Smad3连接至受体复合物，进而增强TGF-β1 的信号传导，而Smad3 能与DNA 发生相互作用，进而活化编码基因的转录调控与信号传导，Smad2 仅能与共激活因子或抑制因子结合，进而调控基因的表达，故推测Smad3 是TGF-β1 的重要调控分子[16-17]。Yang 等[18]等探讨TGFβ1/Smad/α-平滑肌肌动蛋白通路对神经源性膀胱组织学及功能的影响，结果发现TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4、α-平滑肌肌动蛋白、纤连蛋白、colⅠ、col Ⅲ在神经源性膀胱组织中的表达水平均明显升高，TGF-β1可能参与组织学及功能变化的全过程。本研究结果显示，糖尿病大鼠分别敲除TGF-β1、Smad3 后，膀胱平滑肌组织中MMP-13、TIMP-1、colⅠ、col Ⅲ蛋白表达水平均明显降低，进一步证实TGF-β1/Smad3 信号通路可能通过调控MMP-13/TIMP-1 参与DCP 的发生、发展。

综上所述，MMP-13、TIMP-1 在糖尿病膀胱纤维化中呈高表达。TGF-β1/Smad3 信号通路通过调控MMP-13/TIMP-1 蛋白表达参与糖尿病膀胱纤维化的发生、发展。