肺炎支原体对大环内酯类抗生素耐药机制的研究进展

汪慧华, 邹映雪

(1. 天津医科大学 研究生院, 天津, 300350; 2. 天津市儿童医院 呼吸科, 天津, 300350)

肺炎支原体(MP)是儿童呼吸道感染最常见的病原体之一, MP肺炎占住院儿童社区获得性肺炎(CAP)的10%～40%, 每3～7年出现周期性爆发现象[1-3]。MP是能够进行自我复制且能够在体外不依靠活体细胞生存的最小微生物[4], 缺乏细胞壁使得MP对作用于细胞壁的青霉素类、头孢菌类抗生素天然耐药,目前儿童MP感染首选大环内酯类抗生素治疗[5]。近年来, MP感染率逐年升高,大环内酯类抗生素临床使用频繁,世界范围内MP耐药情况严重,中国的MP耐药率亦高达90%以上[6-7],故临床重症和难治性MP感染随之增多。MP感染可导致多系统受累,其中以呼吸系统损伤最为常见,轻症患者多数表现为自限性,但MP对大环内酯类抗生素耐药会造成治疗效果欠佳。与对大环内酯类抗生素敏感的MP菌株相比,耐药菌株会引起更为严重的肺外并发症[8], 甚至导致不可逆的远期损伤[9-10]。鉴于此,探讨MP对大环内酯类抗生素的耐药机制具有重要的临床意义,现将MP对大环内酯类抗生素的耐药机制综述如下。

1 大环内酯类抗生素的作用机制

大环内酯类抗生素是具有大环内酯环结构的一类药物,其中红霉素是最早被发现的天然大环内酯类抗生素; 第2代大环内酯类抗生素为红霉素的半合成衍生物,包括阿奇霉素、罗红霉素、克拉霉素等; 第3代大环内酯类抗生素是酮内酯类药物,以泰利霉素为代表[11]。大环内酯类抗生素的作用机制包括抗菌作用和非抗菌作用。

1.1 抗菌作用

对于每一个细胞而言,蛋白质的合成都是不可或缺的。核糖体是细胞蛋白质合成的场所,由30S小亚基与50S大亚基组成,其中30S小亚基介导信使核糖核酸(mRNA)密码子与转移核糖核酸(tRNA)反密码子之间的相互作用,决定了翻译的保真性; 50S大亚基有助于蛋白质合成的起始、延长和终止,由23S rRNA、5S rRNA和蛋白质组成; 23S rRNA又可以分为6个结构域[12-13], 其中结构域V与肽基转移酶活性密切相关。核糖体通过启动、延伸、终止和核糖体循环4个步骤引导蛋白质的合成。大环内酯类抗生素可以靶向作用于细菌核糖体的23S rRNA,干扰核糖体的功能,阻断蛋白质的合成,抑制细菌的生长,从而起到抗菌作用[14]。

氨基酸在核糖体50S大亚基的肽基转移酶中心(PTC)处形成肽键,合成多肽链,再通过新生多肽的出口隧道(NPET)离开[11, 13]。既往研究[13, 15-16]认为,大环内酯类抗生素可以结合在NPET处,缩短隧道直径,阻碍新生多肽的延长,对核糖体合成的所有蛋白质均有抑制作用,但后期越来越多的研究[17-18]发现,大环内酯类抗生素不是翻译的全局抑制剂,而是翻译的调节剂,可以防止特定氨基酸序列聚集,抑制肽键形成,选择性地干扰蛋白质的合成,这被称为大环内酯类抗生素的“上下文特异性”。此外有研究[19]认为,大环内酯类抗生素还能够诱导编码错误,影响翻译结果。

1.2 非抗菌作用

大环内酯类抗生素的非抗菌作用主要包括抑制炎症反应、减少气道黏液分泌和调节免疫平衡等。

大环内酯类抗生素可以通过影响炎症细胞、炎性因子、气道上皮等而抑制过度和有害的炎症反应。中性粒细胞是主要的抗菌效应细胞,也是炎症反应的重要环节,通过脱颗粒、吞噬、产生活性氧以及释放中性粒细胞胞外陷阱(NETs)杀灭病原菌,但嗜中性粒细胞在持续炎症时可能会释放过量的NETs,对宿主产生损伤[20-22]。研究[23]发现,大环内酯类药物对中性粒细胞具有抑制或稳定作用,可影响NETs释放,表现为浓度依赖性。粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)等为促炎因子,对炎症反应的发生具有重要促进作用,而大环内酯类药物可以抑制这些炎症因子的表达[24-25]。阿奇霉素可以抑制多种促炎途径,但并非完全抑制,而是以调节为主要特征。研究[26]发现,阿奇霉素还可以保护呼吸道黏膜上皮,减轻气道炎症反应所致损伤。

慢性气道炎症的重要特点之一是气道黏液高分泌,大环内酯类药物可以通过调节氯离子通道、抑制杯状细胞增生肥大与抑制黏液分泌基因表达而减轻气道水分和黏液的高分泌状态[27-28]。也有研究[29]认为,大环内酯类药物是通过抑制钠离子通道而减少气道黏液分泌。

目前,关于大环内酯类抗生素对肺部疾病(例如哮喘、慢性阻塞性肺疾病、支气管扩张症和肺囊性纤维化等[25, 30])免疫调节作用的研究已广泛开展,其作用方式主要表现为抑制微生物黏附、阻断毒性因子、抑制生物膜形成以及抑制细胞群体感应[31],例如阿奇霉素能够抑制铜绿假单胞菌对上皮细胞的黏附以及调节上皮细胞的pH值[32]。虽然大环内酯类药物似乎可以加快恢复免疫平衡的速度,并且可能对增强抗菌能力具有一定作用,但是长期使用可能导致耐药以及其他损害。

2 MP对大环内酯类抗生素的耐药机制

2.1 药物作用靶点的基因突变

转肽酶环的突变: 自红霉素被应用于临床后,相关耐药菌株亦在临床中相继出现,研究人员发现对大环内酯类抗生素耐药的细菌核糖体50S大亚基23S rRNA结构域V区的中心环上出现了特定位置的点突变。大环内酯类抗生素与核糖体的结合仅发生于50S大亚基23S rRNA结构域V区[33],因此当该处某些结合位点发生突变时,可能会使大环内酯类抗生素与细菌核糖体结合困难,无法有效阻止细菌蛋白合成,从而导致耐药的发生。1995年LUCIER T S等[34]对耐药MP菌株进行研究发现,耐药菌株的23S rRNA结构域V区中存在A2063G和A2064G突变位点,分别表现为对14元环和16元环大环内酯类抗生素的耐药性,由此提出药物作用靶点的基因突变可能是出现耐药的原因。此后日本的一项研究[35]证实, 23S rRNA的基因突变与耐药有关,主要为2063和2064位点发生A到G的突变,少许菌株存在A到C的突变。目前研究[35-37]已发现的位点包括2062、2063、2064、2067、2611和2617位点,其中存在2063、2064位点突变的MP菌株对14元环、15元环和16元环大环内酯类抗生素均有耐药性,存在2067位点突变的菌株主要对16元环大环内酯类抗生素耐药,而存在2611、2617位点突变的菌株更倾向于对14元环和15元环大环内酯类抗生素耐药。23S rRNA结构域V区A2063和A2064位点的突变频率最高,其产生的耐药性也是最强的[7, 38], 是MP耐药的主要标志,亦是目前的研究重点。

核糖体蛋白的突变: 该突变主要表现为核糖体50S大亚基上L4蛋白和L22蛋白的突变。L22蛋白是50S大亚基的核心蛋白,可以与23S rRNA所有结构域的RNA序列发生相互作用[12]。L4蛋白和L22蛋白共同成为50S大亚基的“支架”,参与NPET收缩位点的构成,形成隧道的最窄部分,并对其具有调节作用[39]。两者发生突变会引起隧道的变化,一方面使大环内酯类药物的结合位点远离该通道而表现为大环内酯类药物耐药,另一方面会影响新生多肽的延伸,使核糖体的翻译率降低[40]。核糖体L4蛋白发生的突变主要表现为H70R、H70L的替换,在60～62位点处插入1～3个甘氨酸; L22蛋白出现连续3次的突变,最终导致泰利霉素的活性完全丧失,而其他大环内酯类、林可酰胺类、链霉素类抗生素和酮内酯类抗生素的活性不变[36]。研究[41]发现,临床分离出的MP耐药菌株与红霉素体外诱导产生的MP耐药菌株在核糖体蛋白L22处存在相同的基因突变,提示使用大环内酯类药物诱导体内产生MP耐药菌株的可能性。中国学者[42]发现,大多数耐药菌株的L4蛋白和L22蛋白基因中存在C162A、A430G、T279C和T508C突变,但未能明确该突变与MP对大环内酯类药物耐药的相关性。也有研究[43-44]认为L4蛋白和L22蛋白突变与MP对大环内酯类药物的耐药性无关,但会引起其他病原菌的耐药,例如肺炎链球菌[45]、大肠杆菌[46]。因此,关于L4蛋白和L22蛋白对MP产生大环内酯类抗生素耐药性的影响有待进一步研究。

核糖体靶点的修饰: 该过程也称为RNA的甲基化修饰,由Erm编码的rRNA-甲基转移酶可通过催化23S rRNA上A2058(大肠杆菌编号,对应MP的A2063位点)位点发生二甲基化而引起核糖体靶点的变化,进而使大环内酯类药物失去对MP的抑制作用[47-48]。ErmB是常见的引起甲基化的基因[49]。14元环和15元环大环内酯类抗生素可诱导大多数Erm基因改变,但目前的研究对该基因的检测样本较少,未来需扩大检测量深入探讨。

2.2 药物主动外排增加

药物的主动外排是耐药的常见原因之一, MP可通过改变细胞膜的成分形成一种特殊的膜蛋白,并通过各种外排泵将药物从细胞内泵出,以降低胞内药物浓度,阻止其作用于靶部位,影响抗生素发挥抑菌作用。这种外排机制并非作用于特定药物,而是对多种抗生素、多种作用机制均有效,在介导多药耐药方面具有重要意义。

对于原核生物而言,外排转运蛋白家族主要有5个,分别为ATP结合盒(ABC)家族、主要易化因子超家族(MFS)、小多耐药家族(SMR)、多重药物与有毒化合物外排家族(MATE)和耐药结节化细胞分化家族(RND)[50]。其中, ABC家族依赖ATP水解供能,其余家族则依赖质子泵功能。与支原体耐药高度相关的是ABC家族,但目前相关研究较少。

ABC转运家族是目前发现的最大的转运蛋白家族之一,几乎存在于所有生物体中,依靠水解ATP提供能量,可将底物进行跨膜运输,在多种生理过程中发挥重要作用,当其底物为药物时,会导致耐药,因而也被称为多药耐药蛋白。迄今为止,临床已发现数百种ABC转运蛋白,目前结构已知的ABC转运蛋白均属于Ⅳ型和Ⅴ型,Ⅳ型按基因型可分为ABCA～ABCH 8个亚家族,其中ABCB、ABCC亚家族与耐药高度相关[51]。有研究[52]将利血平作为外排泵抑制剂,基于体外药代动力学/药效学分析探究托拉霉素对猪MP的抗菌作用,发现猪MP可通过调节不同的ABC转运蛋白表达而达到降低药物敏感性的目的。

由于在抗生素耐药中具有重要作用,外排泵被作为有效的抗菌靶点,相关外排泵抑制剂的的开发将有助于改善微生物的耐药情况。

2.3 药物失活(抗生素酶解)

病原体能够合成某些酶来修饰或降解抗生素,通过改变其结构使其失去活性,这些酶包括β-内酰胺酶、四环素羟化酶、酯酶、乙酰基转移酶、核苷酸转移酶等[53]。大环内酯类抗生素可被病原体合成的磷酸转移酶、酯酶、甲酰还原酶和糖基转移酶灭活。

对大环内酯磷酸转移酶(MPHs)的研究始于1989年, MPHs能够将ATP或GTP的γ-磷酸基团转移至大环内酯类底物上,取代大环内酯的羟基,从而使药物丧失活性。已被报道的MPHs类型包括MPH(A)～MPH(O)共15种亚型,其中MPH(A)编码的磷酸基团以GTP为磷酸基团供体,会导致细菌对14元环和15元环大环内酯类抗生素产生耐药, MPH(B)编码的磷酸基团也偏向于以GTP作为供体,对14元环、15元环、16元环大环内酯类抗生素均耐药[54]。

红霉素酯酶(EREs)能够作用于大环内酯酯键,切断大环内酯环。ERE(A)是EREs中最常见也是最早被发现的,ERE(C)是其同源相似物,两者具有高度序列同源性和相似性,作用方式亦类似。研究[55]发现,红霉素能够紧密结合在ERE(C)的活性中心上,两者结合时该活性中心关闭,反应结束后打开,为下一次催化反应做准备。ERE(A)和ERE(C)对14元环酮内酯、15元环阿奇霉素和16元环交沙霉素、麦迪霉素发挥开环作用,而ERE(B)、ERE(D)对14元环非酮内酯类抗生素和15元环阿奇霉素起效。

3 小结与展望

在MP对大环内酯类抗生素耐药机制相关研究中, 23S rRNA结构域V区基因突变是目前的研究热点,众多研究发现2063位点和2064位点突变率最高,被广泛用于MP耐药检测,但耐药基因突变与临床表现的相关性尚有待进一步研究。研究[37]认为,大环内酯类药物的使用可能诱导体内MP耐药性的出现,但也可能机体本身感染的是耐药菌株,只是由于数量少未被检测出,此后使用大环内酯类药物促进了耐药菌株的增殖,耐药菌株成为优势菌株后才被检测出。值得注意的是,体外耐药性试验与体内实际耐药情况存在一定差异,大环内酯类抗生素耐药机制复杂多样,目前尚未完全阐明,未来需要进一步深入研究。总之,耐药菌株的出现会大大增加临床治疗的难度,在日常工作中,医务人员应规范化使用大环内酯类抗生素,以减少耐药情况的发生,还应尽早识别耐药情况并及时调整与优化治疗方案,从而有效提高儿童MP感染的临床疗效。