以结果验证为导向的中医学八年制Western Blot实践教学

林玩福 梁淑芳 杜娟 翟笑枫 程彬彬

摘要 “实验中医学”是海军军区大学中医学八年制学员的主干课程。其中WesternBlot是研究蛋白水平的基本方法，也是学员所必须掌握的实验研究方法。本课程以结果验证为导向的教学方式革新，最大限度压缩每个步骤的操作时间，聚焦于让学员完成最多的实验步骤，力求实验的完整性。该方法可在一堂课完成实验，展示结果并进行分析讨论。该教学方式有助于在最短时间内掌握完整的Western Blot实验技术，值得进一步推广应用。

关键词 实践教学；Western Blot；实验中医学

中图分类号：G642文献标识码：ADOI：10.16400/j.cnki.kjdk.2023.6.009

《“十四五”中医药发展规划》提出：“推动中医药高质量发展和走向世界，为全面推进健康中国建设、更好保障人民健康提供有力支撑”。中医药若想走向世界并获得国际认可，不仅需要客观疗效，还需要用现代科学语言去解释传统的中医理论以及中药的作用机制[1]。实验中医学是用现代实验的方法和手段来研究中医基础理论、中医诊断、中药和方剂的一门学科，是现代中医药学的一个重要组成部分[2]，对培养中医药创新型人才起着重要作用[3]。

海军军医大学（以下简称“我校”）于2014年在全国医科院校率先开办了中医学专业八年制教育[4]。相较于浙江中医药大学等高校本硕一贯制的中医八年制学员，我校该专业学员毕业授予博士学位。因此，其科研创新能力需以中医学博士研究生的要求为基准，意味着该学制学员需在更短的时间内达到同样的培养目标[5-6]。实验中医学的教学内容涵盖了从整体动物、组织器官、细胞生物、生物分子学到组织形态学等不同层次的研究方法和技术及其在中医药科研中的应用，经过六年的教学探索与改革，该门课程已由原来的60学时大幅增加到现在的102学时，增加的课时以实验课为主，尤其是分子生物学相关的实验课程。并且该课程由最初的第三学年调整为第五学年授课，以便于学员科研选题设计和学位论文研究开展紧密衔接，学以致用。

Western Blot技术又名蛋白质印迹法、免疫印迹法，是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法，可实现对目的蛋白的定性定量及相互作用研究。WesternBlot实验是蛋白质水平的基本实验方法，是學员必须掌握的[7]。常规Western Blot实验通常需要1.5天，受课程安排限制，无法使学员在课堂完成完整的实验。以往的实验教学以视频教学为主，同时观摩其中个别操作为辅，对于初学者来说，很难理解该实验的整体面貌，碎片化的实验操作难以达到课程教学目标。因此，我们通过对教学设计进行调整改革，以最终显色条带为检验标准的结果验证导向进行Western Blot的实验教学，获得良好效果。

1课前准备工作

由于时间关系，该实验课聚焦于Western Blot实验的操作及流程。在课前，教师提前准备好提取的蛋白样品，经过变性及混入loading buffer后可在课堂上直接用于蛋白电泳。因时间有限，教师可在课前准备好课堂使用的凝胶，在电泳过程中再演示及讲解凝胶制备过程。此外，还需要准备与本次实验相关的仪器及耗材，如电泳液、湿转液等。

2教学设计

本次实验课是在前期理论讲解WesternBlot的技术原理、操作的主要过程及在中医药研究中的应用情况的基础上进行的，因此，本次实验课主要进行WesternBlot的实验操作。常规的Western Blot实验需要1.5天时间，而本课程在确保步骤完整、结果可验证的情况下，进行时间的极限压缩，在4学时内带领学员完成抗体孵育、显色及结果反馈，以便于学员理解完整的Western Blot实验操作及结果呈现形式。具体教学设计如表1。

3实验设置

在湿转过程中，操作并讲解Western Blot相关试剂的配置方法，包括电泳缓冲液、湿转缓冲液、TBST等。本实验采用的封闭液为5%脱脂牛奶缓冲液，按照1g脱脂奶粉加入20 mL1 TBST溶液的比例进行配制并充分混匀。现已有制成品的封闭液、电泳缓冲液、湿转缓冲液、TBST等，学员只需了解其原理即可，实验过程中根据具体使用说明书操作。一抗二抗的配制按照抗体说明书的比例，用配制好的5%脱脂牛奶缓冲液进行稀释。转膜完成后，根据marker标记出目标蛋白的位置，然后用塑料薄膜将其覆盖，裁取靶蛋白条带，放入带有封闭液的孵育盒中，室温下摇床上摇动封闭20min。

封闭完成的条带放入含一抗缓释液的孵育盒中，室温条件下摇床上摇动孵育45min。用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次5―10min。二抗孵育45min，后用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次5―10min，最后进行显色。由于显色剂具有光敏性，因此从配显色剂开始至显色完成均需注意避光，显色液应现配现用。显色的时间应根据蛋白表达丰度决定，可以从短时间开始，如果曝光不理想则适当延长曝光时间，应注意曝光时间短显色不明显，同时也要避免曝光时间长，过度曝光占用条带泳道影响结果解读。将显色结果通过班级群向学员反馈，并提出最终实验结果的解读及问题分析，指导学生完成实验记录。

4学员评价

学员评价分两部分完成，第一部分是反馈结果并进行结果解读和问题分析之后，提问学员对整个实验的理解及感受，当天进行实验操作的评价，并将其记录于实验记录中。第二部分评价由下次实验课课前回顾完成，首先通过检查学员关于Western Blot实验的记录本，因所有人均进行了相关的实验操作，因此从记录可以看出其真实学习及掌握情况，避免存在随便抄写实验记录的情况。其次通过提问，Western Blot实验包括哪些部分，各部分的操作技巧及注意点等，客观评价学员对该实验的掌握情况。

5经验总结

Western Blot是蛋白水平研究的基础分子生物学实验之一，也是揭示中医药作用的分子机制、促进中医药发展的重要手段，是学员必须掌握的实验研究方法[8-9]。既往的教学多以理论讲解技术原理为主，即使是实验操作课，由于时间的限制，往往只截取其中某一步骤让学员进行体验式操作，易造成碎片化理解的劣势，无法真正为即将进行的学位论文研究打下坚实基础。以结果验证为导向的教学方式革新，以最大限度压缩每个步骤的操作时间，聚焦于让学员动手操作完成实验的最多步骤，力求实验的完整性，并在当天完成实验结果并进行分析讨论，符合记忆特点，便于学员更好掌握。

当然，该实验方式也存在一些限制，首先受限于实验仪器及教员数量，为达到最好的教学效果，该实践教学仅适合于小班课（一般少于20人）。其次，由于大部分实验步骤进行了时间压缩，因此在操作间隙要不断提示学员与常规操作的区别，阐述其中的技术原理，引导学员正确认识。再者，通过结合视频教学等方式，可以进一步强化学员对Western Blot技术的理解。

*通讯作者：程彬彬

基金项目：海军院校重点建设教材——《实验中医学》。

参考文献

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