当归补血汤含药血清抑制JAK2/STAT1/3信号通路诱导人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡的机制研究

赵莹，王爽，潘志，汪少琼，王颖航（.长春中医药大学，吉林 长春 307；.长春中医药大学第一附属医院，吉林 长春 307）

类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一种病因不明的慢性全身性自身免疫性疾病。类风湿关节炎的主要病理特征为滑膜增生，并逐渐引起关节软骨及骨侵蚀，最终可致关节畸形甚至残疾[1]。类风湿关节炎的病理变化过程与类风湿成纤维样滑膜细胞密切相关[2]。越来越多的证据[3]表明，类风湿成纤维样滑膜细胞具有抗凋亡及肿瘤样扩张特性。Janus激酶/信号转导与转录激活因子（JAK/STAT）信号通路参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要生物学过程，同时也参与了类风湿关节炎的病理进展[4]。目前，JAK 抑制剂已被广泛应用于类风湿关节炎的治疗并取得良好疗效[5]。

当归补血汤源自李东垣的《内外伤辨惑论》，由黄芪、当归按5∶1 比例组成，是补气生血的代表方[6]。临床上用当归补血汤治疗类风湿关节炎疗效确切[7-9]。现代药理学研究[10]表明，当归补血汤具有促进造血功能、调节免疫、防治骨科疾病、抗纤维化、抗肿瘤等多种药理作用。黄芪的主要成分黄芪杂多糖可诱导佐剂性关节炎大鼠膝关节滑膜细胞凋亡，抑制促炎因子分泌[11]。当归的主要化学成分阿魏酸能显著改善抗原诱导性关节炎大鼠的滑膜炎症和软骨破坏[12]。本课题组前期研究[13]证实，当归补血汤含药血清具有抑制肿瘤坏死因子α（TNF-α）诱导的人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞（HFLS-RA）增殖的作用，可能与其调控Th17/Treg 平衡、抑制炎症反应相关。故本研究拟进一步观察当归补血汤含药血清对HFLS-RA 细胞凋亡及凋亡相关通路JAK/STAT 信号通路的影响，以期阐明当归补血汤抗类风湿关节炎的潜在机制。

1 材料与方法

1.1 细胞及动物人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞（HFLS-RA），购自北京北纳创联生物技术研究院，取3～7 代细胞用于实验。SPF 级健康雄性Wistar 大鼠42 只，体质量（200±20）g，购自吉林省长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，实验动物生产许可证号：SCXK（吉）2020-0002。动物饲养于长春中医药大学动物实验中心，温度（23±2）℃，相对湿度（50±5）%，实验动物使用许可证号：SYXK（吉）2018-0014。本实验经长春中医药大学动物实验伦理委员会审查，批文号：2021361。

1.2 药物及试剂当归、黄芪药材，购自吉林大药房，批号：200407，经长春中医药大学蔡广知副教授鉴定为正品；雷公藤多苷片，上海复旦复华药业有限公司，批号：20191204。Cell Counting Kit-8 细胞计数试剂盒（CCK-8），合肥兰杰柯科技有限公司，批号：21 139519；肿瘤坏死因子α（TNF-α），美国Pepro Tech 公司，批号：300-01A-10；白细胞介素15（IL-15）ELISA 检测试剂盒（批号：20210701-10341A）、白细胞介素6（IL-6）ELISA 检测试剂盒（批号：202110701-10377A），上海酶联生物科技有限公司；总RNA 提取试剂盒，北京天根生化科技有限公司，批号：U8907；Bioteke super RT Kit，北京泰克生物技术公司，批号：B020 009018；2×Hieff®Robust PCR Master Mix（With Dye），上海翊圣生物科技公司，批号：H0 001061；B 细胞淋巴瘤2（Bcl-2）、Bcl-2 相关X 蛋白（Bax）、半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）引物，由生工生物工程上海股份有限公司合成；GAPDH 抗体，美国Bioworld 公司，批号：AP0063；兔抗人磷酸化酪氨酸激酶2（p-JAK2）抗体（批号：AP0531）、兔抗人磷酸化信号传导及转录活化因子1（p-STAT1）抗体（批号：AP0453）、兔抗人磷酸化信号传导及转录活化因子3（p-STAT3）抗体（批号：AP0715）、Bax 抗体（批号：A19684）、Bcl-2 抗体（批号： A20777）、 caspase- 3 抗体（批号：A11040），武汉爱博泰克（ABclonal）生物科技有限公司；Goat anti-Rabbit IgG（H＆L）-HRP，北京博奥森生物技术有限公司，批号：AF12 114126；RIPA 细胞裂解液、 BCA 蛋白浓度测定试剂盒（批号：120219200821），上海碧云天生物技术公司。

1.3 主要仪器RT-6100 型酶标仪，深圳雷杜生命科学股份有限公司；ETC811 型基因扩增仪，苏州东胜兴业科学仪器有限公司；165-8000 型电泳仪、170-3930 型转膜仪，美国Bio-Rad 公司；FL1000 型智能成像系统，美国Thermo Fisher Scientific 公司；A00-1-1102 型流式细胞仪，美国贝克曼库尔特公司。

1.4 当归补血汤含药血清制备将42 只Wistar 大鼠随机分为空白组（14 只）、雷公藤多苷组及当归补血汤低、中、高剂量组，每组7 只。当归补血汤按原方配伍比例（黄芪∶当归=5∶1）称取，常规煎煮浓缩至水煎液浓度为1.5 g·mL-1，4 ℃下储藏备用。按人与动物体表面积换算，当归补血汤低、中、高剂量组按照15、7.5、3.75 g·kg-1剂量灌胃给药，雷公藤多苷组灌胃给药剂量为9.45 mg·kg-1，空白组灌胃等体积生理盐水，每天灌胃给药2 次，连续7 d。末次给药2 h 后，各组大鼠进行腹主动脉采血，收集血清，56 ℃灭活，-20 ℃保存备用。

1.5 细胞分组及干预将HFLS-RA 细胞随机分为6 组，即空白组（10%空白组大鼠血清培养基）、模型组（20 ng·mL-1TNF-α+10%空白组大鼠血清培养基）、雷公藤多苷组（20 ng·mL-1TNF-α+10%雷公藤多苷组大鼠血清培养基），以及当归补血汤含药血清低、中、高剂量组（20 ng·mL-1TNF-α+10%当归补血汤低、中、高剂量组大鼠血清培养基）；按照分组设置加入终质量浓度为20 ng·mL-1的TNF-α，1 h 后加入相应含药（或空白）血清处理24 h。

1.6 CCK-8 法检测HFLS-RA 细胞增殖活性待HFLS-RA 细胞密度达到85%左右时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，计数，以每孔5×104个·mL-1的密度接种于96 孔细胞培养板；细胞分组同“1.5”项下，每组设置6 个复孔，培养过夜；按照分组设置加入终质量浓度为20 ng·mL-1的TNF-α，1 h 后加入相应含药（或空白）血清处理24、48 h；然后向每孔中加入10 μL CCK-8 溶液，继续孵育1 h；采用酶标仪在450 nm 波长处检测各孔细胞光密度（OD）值。

1.7 流式细胞术（Annexin V-FITC/PI 双染法）检测HFLS-RA细胞凋亡将HFLS-RA细胞以2×105个·mL-1的密度接种于6 孔板中，细胞分组及干预同“1.5”项下；干预24 h 后，按照试剂盒说明书步骤收集细胞，并重新悬浮在PBS 中；细胞计数、离心后重新悬浮在195 μL 结合缓冲液中；先后加入5 μL Annexin V-FITC 和10 μL PI，轻轻混匀，室温下避光孵育15 min；采用流式细胞术检测细胞凋亡率。

1.8 RT-PCR 法检测细胞中Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA 表达细胞分组及干预同“1.5”项下。培养24 h 后弃细胞上清，加入1 mL RZ 裂解液，提取总RNA，检测RNA 含量和纯度（A260/A280=1.7～2.1）；反转录合成cDNA，反应条件为：42 ℃、50 min，70 ℃、10 min；进行PCR 扩增反应，反应体系：50 μL，反应条件：94 ℃、5 min，94 ℃、30 s，55 ℃、10 s（循环40 次），72 ℃、30 s，72 ℃、10 min；PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，测定目的基因、内参基因灰度值，以两者比值作为目的基因相对表达量；每个样品设置3 个复孔，平行实验3 次。引物序列见表1。

表1 PCR 引物序列Table 1 Primer sequences for PCR

1.9 ELISA 法检测细胞上清液中IL-6、IL-15 水平细胞分组及干预同“1.5”项下。培养24 h 后收集细胞上清液，离心，-20 ℃下保存；严格按照试剂盒说明书步骤检测IL-6、IL-15 水平。

1.10 Western Blot 法检测细胞中Bax、Bcl-2、caspase-3、p-JAK2、p-STAT3、p-STAT1 蛋白表达水平细胞分组及干预同“1.5”项下。培养24 h 后收集各组细胞，加入RIPA 细胞裂解液30 min 后，以4 ℃、12 000 r·min-1（离心半径4 cm）离心5 min，收集上清液；采用BCA 蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。制胶（10%、12%分离胶，5%浓缩胶），上样后以SDS-PAGE 电泳法分离蛋白质样品（80 V、30 min跑上层胶，120 V、50 min 跑下层胶）；电泳结束后进行蛋白转膜（250 A、100 min），用5%脱脂奶粉封闭1 h 后，TBST 洗膜3 次，每次10 min；4 ℃下孵育一抗［GAPDH（1∶2 500）、Bax（1∶500）、Bcl-2（1∶500）、caspase-3（1∶500）、p-JAK2（1∶800）、p-STAT3（1∶1 000）、p-STAT1（1∶1 000）］ 过夜，TBST 洗膜3 次，每次10 min；室温下摇床孵育二抗（1∶1 000）1 h，TBST 洗膜3 次，每次10 min；滴加化学发光液ECL 显色，在凝胶成像系统中曝光；采用ImageJ 图像分析软件测定各蛋白条带灰度值，以GAPDH 为内参，对目的蛋白进行半定量分析。

1.11 统计学处理方法采用SPSS 19.0 统计软件进行数据分析；计量资料以均数±标准差（±s）表示；多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用LSD 法，方差不齐则采用Dunnett’s T3法检验；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 当归补血汤含药血清对TNF-α 诱导HFLS-RA细胞增殖活性的影响结果见表2。与空白组比较，模型组HFLS-RA 细胞的增殖活性显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，雷公藤多苷组及当归补血汤含药血清各剂量组HFLS-RA 细胞的增殖活性均显著降低（P＜0.01）。结果表明，不同浓度的当归补血汤含药血清均对TNF-α 诱导的HFLS-RA 细胞增殖活性有显著抑制作用，并呈浓度依赖性。

表2 当归补血汤含药血清（DBD）对TNF-α 诱导人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖活性的影响（±s，n=6）Table 2 The effect of Danggui Buxue Decoction-containing serum on the proliferation of human fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis induced by TNF-α（±s，n=6）

表2 当归补血汤含药血清（DBD）对TNF-α 诱导人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖活性的影响（±s，n=6）Table 2 The effect of Danggui Buxue Decoction-containing serum on the proliferation of human fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis induced by TNF-α（±s，n=6）

注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01

OD 值0.394 9±0.007 3 0.506 7±0.008 7**0.350 0±0.002 8##0.400 9±0.009 9##0.393 5±0.006 0##0.371 3±0.006 3##组别空白组模型组雷公藤多苷组DBD 低剂量组DBD 中剂量组DBD 高剂量组

2.2 当归补血汤含药血清对TNF-α 诱导HFLS-RA细胞凋亡率的影响结果见图1。与空白组比较，模型组HFLS-RA 细胞的凋亡率明显下降（P＜0.05）。与模型组比较，雷公藤多苷组及当归补血汤含药血清各剂量组HFLS-RA 细胞的凋亡率显著升高（P＜0.05，P＜0.01）。结果表明，不同浓度的当归补血汤含药血清均可促进TNF-α 诱导的HFLS-RA 细胞凋亡。

图1 当归补血汤含药血清（DBD）对TNF-α 诱导人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡率的影响（±s，n=3）Figure 1 Effect of Danggui Buxue Decoction-containing serum on apoptosis rate of human fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis induced by TNF-α（±s，n=3）

2.3 当归补血汤含药血清对TNF-α 诱导HFLS-RA细胞Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA 表达的影响结果见图2。与空白组比较，模型组HFLS-RA 细胞的Bax、caspase-3 mRNA 表达水平显著降低（P＜0.01），而Bcl-2 mRNA 表达水平显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，雷公藤多苷组及当归补血汤含药血清各剂量组HFLS-RA 细胞的Bax、caspase-3 mRNA 表达水平均显著升高（P＜0.01），而Bcl-2 mRNA 表达水平显著降低（P＜0.01）。结果表明，不同浓度的当归补血汤含药血清能显著上调TNF-α 诱导的HFLS-RA 细胞促凋亡因子Bax、caspase-3 mRNA 的表达，下调抗凋亡因子Bcl-2 mRNA 的表达，从而发挥促HFLS-RA 细胞凋亡的作用。

图2 当归补血汤含药血清（DBD）对TNF-α 诱导人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA表达的影响（±s，n=3）Figure 2 Effect of Danggui Buxue Decoction-containing serum on the mRNA expression levels of Bax，Bcl-2 and caspase-3 in human fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis induced by TNF-α（±s，n=3）

2.4 当归补血汤含药血清对TNF-α 诱导HFLS-RA细胞中IL-6、IL-15 水平的影响结果见表3。与空白组比较，模型组HFLS-RA 细胞的IL-6、IL-15水平显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，雷公藤多苷组及当归补血汤含药血清各剂量组HFLS-RA 细胞的IL-6、IL-15 水平均显著降低（P＜0.01）。结果表明，当归补血汤含药血清能显著降低TNF-α 诱导的HFLS-RA 细胞的炎性因子水平，减轻炎症反应。

表3 当归补血汤含药血清（DBD）对TNF-α 诱导人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中IL-6、IL-15 水平的影响（±s，n=6）Table 3 Effect of Danggui Buxue Decoction-containing serum on the expression levels of IL-6 and IL-15 in human fibroblastlike synoviocytes in rheumatoid arthritis induced by TNF- α（x ± s，n=6）

表3 当归补血汤含药血清（DBD）对TNF-α 诱导人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中IL-6、IL-15 水平的影响（±s，n=6）Table 3 Effect of Danggui Buxue Decoction-containing serum on the expression levels of IL-6 and IL-15 in human fibroblastlike synoviocytes in rheumatoid arthritis induced by TNF- α（x ± s，n=6）

注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01

IL-15/（pg·mL-1）37.74±1.11 57.91±1.16**43.46±0.81##50.30±0.90##45.72±0.51##44.20±1.12##组别空白组模型组雷公藤多苷组DBD 低剂量组DBD 中剂量组DBD 高剂量组IL-6/（pg·mL-1）25.34±2.88 52.10±1.24**26.10±0.95##44.82±1.41##40.95±1.35##38.00±2.26##

2.5 当归补血汤含药血清对TNF-α 诱导HFLS-RA细胞Bax、Bcl-2、caspase-3 蛋白表达的影响结果见图3。与空白组比较，模型组HFLS-RA 细胞的抗凋亡因子Bcl-2 蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），而促凋亡因子Bax、caspase-3 蛋白表达水平及Bax/Bcl-2 比值显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，雷公藤多苷组及当归补血汤含药血清各剂量组HFLSRA 细胞的Bcl-2 蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05，P＜0.01），Bax、caspase-3 蛋白表达水平及Bax/Bcl-2 比值均显著升高（P＜0.01）。结果表明，不同浓度的当归补血汤含药血清能显著上调TNF-α 诱导的HFLS-RA 细胞促凋亡因子Bax、Caspase-3 蛋白表达，下调抗凋亡因子Bcl-2 蛋白表达，从而发挥促HFLS-RA 细胞凋亡的作用。

图3 当归补血汤含药血清（DBD）对TNF-α 诱导人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞Bax、Bcl-2、caspase-3 蛋白表达的影响（±s，n=3）Figure 3 The effect of Danggui Buxue Decoction-containing serum on the protein expression levels of Bax，Bcl-2，caspase-3 in human fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis induced by TNF-α（±s，n=3）

2.6 当归补血汤含药血清对TNF-α 诱导HFLS-RA细胞p-JAK2、p-STAT1、p-STAT3 蛋白表达的影响结果见图4。与空白组比较，模型组HFLS-RA 细胞的p-JAK2、p-STAT1、p-STAT3 蛋白表达水平均显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，当归补血汤含药血清中、高剂量组HFLS-RA 细胞的p-JAK2、p-STAT1、p-STAT3 蛋白表达水平均显著降低（P＜0.01）。结果表明，当归补血汤含药血清可能通过抑制JAK/STAT 信号通路的转导来实现对HFLS-RA 细胞的促凋亡作用。

图4 当归补血汤含药血清（DBD）对TNF-α 诱导人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞p-JAK2、p-STAT1、p-STAT3 蛋白表达的影响（±s，n=3）Figure 4 The effect of Danggui Buxue Decoction-containing serum on the protein expression levels of p-JAK2，p-STAT1 and p-STAT3 in human fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis induced by TNF-α（±s，n=3）

3 讨论

类风湿关节炎（RA）是一种慢性、对称性侵害关节和关节周围组织，以关节滑膜病变为主要病变的全身性、自身免疫性疾病，其临床表现与中医典籍中记载的“历节”“鹤膝风”“尪痹”“骨痹”“顽痹”等相似，现多将其归属于“痹证”的范畴[14-15]。有研究[8]认为，类风湿关节炎的基本病机为本虚标实，脏腑因湿热毒久蕴，耗气伤血，“血气凝涩，不得流通关节，诸筋无以滋养，真邪相搏，所历之节，悉皆疼痛，故为历节风也。痛甚则使人短气汗出，肢节不可屈伸”，故选用当归补血汤气血双补而不壅遏病邪。名老中医李堪印教授临证50 余载，运用中西结合思路，善用黄芪为君药组方治疗痹症，屡有奇效[9]。临床治疗“痹证”组方用药规律研究[16]发现，当归使用频次最高。当归补血汤在类风湿关节炎的治疗中，无论是单独使用或是与西药联合运用均显示出其优势。

类风湿关节炎的发病机制尚未明确，受多种因素包括遗传、环境、免疫紊乱及细胞因子等影响。类风湿关节炎的主要病理特征是滑膜细胞的异常增殖，成纤维样滑膜细胞（FLS）是滑膜炎的主要效应细胞，其具有肿瘤样扩张特性，影响类风湿关节炎微环境稳态，加速疾病进展。FLS 对细胞凋亡有抵抗力，导致其过度增殖与凋亡之间的不平衡，进而促使关节软骨的破坏[17-18]。研究[19]表明，Bcl-2、Bax 在细胞凋亡发生过程中发挥重要作用，Bax/Bcl-2 比值变化可以触发信号，启动凋亡级联反应；caspase-3被激活后，细胞底物会被降解或裂解，最终可促使细胞凋亡。研究[20]发现，在类风湿关节炎患者的FLS中，促凋亡蛋白Bax 表达水平降低，而抗凋亡蛋白Bcl-2 表达水平升高。TNF-α 诱导HFLS-RA 细胞异常增殖是药物治疗类风湿关节炎体外实验研究的经典模型[21]。本研究结果显示，当归补血汤含药血清对TNF-α 诱导的HFLS-RA 细胞增殖活性有显著抑制作用，其能显著上调促凋亡因子Bax、Caspase-3 的蛋白表达，下调抗凋亡因子Bcl-2 的蛋白表达，从而发挥促HFLS-RA 细胞凋亡的作用。

研究[22]显示，IL-6/STAT3 信号通路在炎症及肿瘤疾病中发挥重要作用，IL-6 可通过细胞膜上相应的酪氨酸激酶相关受体来激活STAT3 表达，诱导肿瘤细胞的增殖。抑制IL-6/STAT3 信号通路的激活，可促进肿瘤细胞的凋亡。有研究[23-24]表明，IL-15 可促使细胞增殖，抑制细胞凋亡，促进T 细胞的存活、增殖以及下游效应，包括诱导JAK/STAT 途径激活。许多细胞因子通过JAK/STAT 来转导细胞内信号，在类风湿关节炎滑膜关节组织中持续激活，分泌大量炎症介质，进而加重滑膜炎症[25]。有研究[26]发现，类风湿关节炎滑膜组织中STAT1/STAT3 被激活，导致抗凋亡分子表达上调，从而抑制细胞凋亡过程。研究[27]表明，JAK2/STAT1/3 可能是FLS 增殖抑制作用的上游机制。JAKs 在细胞信号传导途径参与调节免疫和炎症过程中发挥了至关重要的作用。针对JAK 家族成员的干预可造成免疫抑制或抗炎效果，JAK 激酶抑制剂对类风湿关节炎可能发挥有益的治疗效果[28]，抑制其表达和激活被认为是治疗类风湿关节炎的一种新策略[29]。本研究结果显示，在TNF-α 作用下HFLS-RA 细胞内IL-6、IL-15 水平显著升高，JAK2/STAT1/3 信号通路被激活，JAK2、STAT1 和STAT3 表现出高度磷酸化，进而导致细胞异常增殖与凋亡抵抗；而当归补血汤含药血清干预后，HFLS-RA 细胞的IL-6、IL-15 水平均显著降低，并有效抑制JAK2、STAT1 和STAT3 的磷酸化，减轻炎症反应，诱导细胞凋亡。结果提示，当归补血汤含药血清诱导HFLS-RA 细胞发生凋亡进而发挥抗类风湿关节炎的作用可能与其抑制JAK2/STAT1/3信号通路传导有关。

综上所述，当归补血汤含药血清对TNF-α 诱导的异常增殖的HFLS-RA 细胞有较好的抑制作用，同时能降低其凋亡抗性，调节其过度增殖与凋亡之间的不平衡，其机制可能与抑制细胞内JAK2、STAT1、STAT3 磷酸化蛋白的活化，阻断JAK2/STAT1/3 信号通路转导有关。本研究从细胞层面为当归补血汤治疗类风湿关节炎提供了初步证据，但有待通过进一步的动物药效实验进行验证。