基因编辑技术在疾病治疗方面的应用进展*

刘梓航, 蔡祥胜, 杨翌, 孙筱放, 谢英俊△

1广州医科大学附属第三医院妇产科研究所、广东省产科重大疾病重点实验室、广东省普通高校生殖与遗传重点实验室、广州医科大学附属第三临床学院(广东广州 510150); 2中国科学院大学深圳医院转化医学研究院(广东深圳 518601)

近年来,基因编辑技术在人类疾病治疗方面发挥着越来越重要的作用,该技术能够靶向目标生物体基因序列进行较为精确的修饰。基因编辑技术包括巨型核酸酶、锌指核酸酶、转录激活样效应因子核酸酶和CRISPR-Cas技术。本文将在综述基因编辑技术简要分类的基础上,比较其之间的优劣,并介绍近年来基因编辑技术在疾病治疗方面的应用进展,探讨基因编辑技术的前景和突破方向。

1 基因编辑技术的原理

基因编辑工具是结构和序列特异性的核酸酶,它在目标基因组的特定位置产生双链断裂重组(DSB)[1],并通过两种机体的自然机制诱导生物体修复DSB:非同源末端连接(NHEJ)和同源介导的双链DNA修复(HDR)。NHEJ修复途径不依靠模板,机制简单,反应比HDR更快,但容易出错,容易导致基因序列的破坏[2]。而当存在修复模板时,即完整原始的姐妹染色单体同源序列,生物体就会启用HDR修复途径[3]。随着医学和生物科技领域的不断发展,许多基因编辑新技术开始迅速发展起来,并且扩充了基因编辑技术工具箱,开拓了新的研究和应用领域。其中CRISPR-Cas9系统具有跨时代的重大意义,基因编辑技术还包括同源重组、大范围核酸酶技术(meganuclease)、锌指蛋白(zine finger protein,ZFP)技术、转录激活样效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALEN)等(表1)。

表1 基因编辑技术的分类及比较

各类基因编辑技术发展现状:

天然大范围核酸酶的种类一直以来严重限制了大范围核酸酶参与基因编辑的应用,这是因为大部分的天然大范围核酸酶在人类基因组上的应用和研究很难找到匹配的识别和靶向位点,并且往往伴随着一些细胞毒性作用和脱靶效应。辅助因子的离子类型还会影响脱靶效应,例如:有研究表明使用锰代替镁的方法可以减少错配序列的发生,但这会显著影响编辑效率[9]。

ZFN技术也存在相应的技术难题:就应用程度方面而言,因为实验需要而开发新的ZFN,这需要开发人员具备在蛋白质工程等技术方面的专业知识[5]。从安全性方面来说,ZFP间隔区长度、同源和异源二聚体的形成以及相邻锌指之间的相互作用与脱靶率密切相关[23-24]。

TALENs的特异性结合效率受到多方面的靶影响,包括细胞类型、靶点、作用持续时间和使用的传递系统。在重复单元的两侧截断TALE支架或者将催化中心放在更合适的位置可以提高20%TALEN的修饰率和蛋白质稳定性,同时还能降低细胞毒性[25]。但一些增强其特异性修饰率的修改可能会降低基因编辑的效率。例如,当使用某些重复可变双残基(如用于识别鸟苷酸的NH和NK)时,重组TALE蛋白的活性会显著降低,从而影响基因编辑效率[13, 26]。由于难以准确预测TALEN脱靶活性,想要扩大临床应用,则需要进行更多更为详细的分析。

CRISPR-Cas系统的编辑效率和特异性在不同的基因组位点上存在很大差别,而且与之前提到的TALEN和ZFN相比,CRISPR-Cas系统具有更高的脱靶率。另外,关于CRISPR-Cas系统,最近有研究提出了一些新问题:正常人体内可能存在针对CRISPR-Cas系统的免疫细胞和免疫分子。例如,Charlesworth 团队在来自健康成人样本的很大一部分捐献者中检测到针对SaCas9(SaCas9 Nuclease)和SpCas9(SpCas9 Nuclease)的抗体(分别占67%和42%)。此外,在血清供体中,抗SaCas9和SpCas9的抗原特异性T细胞(分别占78%和67%)的检出率也很高[27]。这些发现引发了科研人员的思考,即使用该技术修饰的细胞可能会被患者的免疫系统识别并清除。往好处想:这仅仅只会使治疗靶向细胞被免疫系统破坏而导致基因编辑治疗效率降低;而考虑到人类与微生物接触的频繁性,则可能会在使用CRISPR-Cas系统产生的免疫反应中,导致特异性免疫毒性反应而产生不良结果。随着CRISPR-Cas系统走向临床试验,这一容易忽视的方面需要引起十分的注意。

2 基因编辑技术的优劣势

在理想的情况下,基因编辑技术可以不需要同源模板来编辑任意基因位点,同时产生较少的副产物和双链断裂,具有高特异性、高效率的特点,应用潜力大[28-30]。

CRISPR新技术的发展使得具有普遍性、DNA特异性、产品选择性以及自然CRISPR系统的基本功能得到了改善,也促进了这种技术的创新和改变,研究人员还利用这些技术用来研究生命系统和开发人类疾病的新工具[30]。基因编辑新技术用于治疗遗传疾病最能凸显其价值。

基因编辑工具的不断扩充和发掘向我们展示了基因编辑技术运用的广泛性和可塑性,并被应用在更多的方面和模型中,这在基因治疗的选择和开发中起到推动作用。例如,最近有研究显示CRISPR-Cas9增加了在细胞和生物体模型中插入、删除或编辑遗传信息便利性,还可以用来促进基因型-表型的分析。最近有项研究就举例说明了如何借助CRISPR系统识别细胞毒性组蛋白脱乙酰酶抑制剂曲古抑菌素A(trichostatin A, TSA)抗性相关的基因[31]。

基因编辑技术可以从发病机制上根治多种疾病。从理论和实验来看,基因治疗非常有效的,且可以保持长期的稳定性。然而,治疗的安全性和有效性以及涉及到的一系列伦理问题是无法忽视和避免的问题。基因编辑的不规范使用会给人类以及生物界的基因库带来潜在的麻烦,并且经过不恰当基因修饰的人群会引发一系列社会伦理问题,对于人类的社会治安和公平问题产生非常大的冲击。例如,2018年发生的“免疫艾滋病基因编辑婴儿事件”就是非常恶劣的伦理问题。过度使用基因编辑也将从基因的层面对人体造成不可逆转的影响,危害人类的长期发展[32]。在技术、社会、自然之间谋求一种稳定是基因编辑技术应用最理想的状态。

3 基因编辑技术目前研究的技术瓶颈

3.1 如何减少脱靶现象以及基因毒性反应 目前基因编辑技术遇到的最大问题就是如何减少技术的脱靶率以及预测并避免脱靶。对CRISPR系统进行改良其特异性,减少脱靶事件,这是许多科研人员都在努力的方向和目标。

另外,如何增加基因编辑技术的安全性一直是一个困难且必须面对的问题。因为基因编辑引起的毒性反应也是十分常见的。其中,对生产基因编辑工具中所涉及的基因毒性杂质来源进行评估,分析其制造过程,考虑起始物质、中间物质、溶剂等,以免毒性物质的产生和掺杂,这些可以启发我们如何减少基因毒性作用。

3.2 基因编辑效率和准确性需要提高 依赖HDR同源修复的较为精准基因编辑具有更广泛的应用前景,但是与已经建立的基因编辑系统的编辑效率相比,其远远低于由NHEJ修复介导的非精确的编辑系统。因此,我们需要通过优化现有的系统或者研发新的技术从而突破当前的技术瓶颈,改善目前存在的技术高效率和高精确度不能并存的劣势。

3.3 靶向细胞的基因维持有效的问题 最近,有荟萃分析表明CRISPR-Cas9编辑的造血干细胞和祖细胞显示出与早期植入对照组相比,基因编辑细胞的持久性在后期和二次移植接受者中降低的问题。针对血红蛋白基因的研究分析显示,无论使用HDR还是NHEJ,基因编辑后细胞维持有效性的能力都显著降低[33]。靶向造血干细胞的移植持久性依旧是一个巨大的挑战。

3.4 基因编辑中聚合物材料的研发与改进对于基因编辑过程有着重大意义 在基因治疗中,聚合物材料在基因传递的灵活程度、成本的缩减方面拥有巨大的潜力,并且聚合物材料不受病毒载体和免疫原性问题的影响,因此科研人员对使用聚合物材料存在极高的热情和兴趣。为了解决效率和生物相容性的问题,在聚合物材料上的新发现对基因治疗的实际应用有着重大的影响。

最近有研究发现,通过2%～11.5%的聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)的琥珀酰化作用生产了一系列两性离子样聚乙烯亚胺衍生物(zPEI)。琥珀酰化作用后,与未修饰的PEI相比,zPEI复合物表现出血清蛋白聚集减少,并且在竞争性聚阴离子存在下更容易解离的特性。另外,血清介导的基因传递显示,在HEK293和HeLa细胞中,仅2%的PEI的琥珀酰化能够使转基因表达量比未修饰的PEI高260～480倍,比已经商业化PEI-PEG2k高50～65倍。该研究还表明:2%琥珀酰化很大程度上不会降低聚合物-DNA结合能力以及与血清蛋白的相互作用,反而这种小的修饰能明显地增加基因编辑的表达和基因敲入的效率[34]。

这些最新的研究成果表明聚合物材料的研发与改进对于基因编辑过程有着重大意义,能显著提高基因编辑的表达和增强基因编辑带来的效果,提升基因编辑的效率和预期效果,更好地解决疾病问题。

4 基因编辑技术在疾病治疗方面的应用

自基因编辑技术的诞生到现在的蓬勃发展,基因编辑在疾病治疗领域有着重大的发展前景。特别是在过去的十年中,由于CRISPR-Cas系统的开发,基因编辑领域取得了不少令人瞩目的疾病治疗研究成果。利用基因编辑技术可提供治疗单基因遗传病、癌症肿瘤、线粒体疾病等新的治疗方法和治疗思路,展现出强大的应用前景。基因编辑技术在疾病治疗中的应用见表2。

表2 基因编辑技术在疾病治疗方面的应用

4.1 基因编辑在治疗人类单基因遗传疾病方面的应用 大多数人类遗传病都是基因中单一碱基的突变引起的。例如,当胞嘧啶(C)替换为尿嘧啶(U)时,需要通过氧化脱氨作用脱去一位点上的氨基;而腺嘌呤(A)替换为鸟嘌呤(G),则需脱去另一位点上的氨基。这种变化可以通过酶的催化作用来实现。因此,单碱基编辑技术的基本原理是通过工具酶确定突变位点,然后进行氧化脱氨作用实现碱基对的替换[47]。

β-地中海贫血是我国华南地区常见的遗传血液病,在广东省的人群携带率接近10%,在广西携带率更是可达到20%[35]。中山大学研究团队利用BE3系统(胞嘧啶脱氨酶单碱基编辑技术CBE或BE:分为BE1, rAPOBEC1-XTEN-dCas9; BE2, rAPOBEC1-XTEN-dCas9-UGI和BE3, rAPOBEC1-XTEN-Cas9n-UGI三种[36])针对HBB-28(A>G)致病点突变首次在人类体细胞和胚胎中进行了编辑修复的研究工作[37]。

遗传性血色病(hereditary hemochromatosis, HH)也是一种与铁储存相关的常染色体隐性遗传病。在HH中,G-A突变导致人HFE基因中的C282Y突变,这会导致患者铁的过量吸收。将ABE碱基编辑器应用于淋巴母细胞系,使基因第282位的致病性酪氨酸替换为半胱氨酸[48]。尽管ABE碱基编辑器效率不高,但其在治疗疾病中有着巨大潜力。

另外一种疾病:着色性干皮病,其C组蛋白(xeroderma pigmentosum group C, XPC) 是一种起到DNA修复作用的核酸内切酶,参与识别和修复被紫外线损伤的皮肤的DNA。缺乏XPC的细胞容易损伤导致着色性干皮病。有研究人员通过使用腺嘌呤单碱基编辑器(adenine base editor, ABE)对着色性干皮病患者的成纤维细胞进行编辑,恢复了关键蛋白XPC的表达并至少维持了4周,在紫外线照射下,细胞在一定程度上恢复了对DNA损伤的抵抗能力[38]。这个结果证明通过ABE编辑校正突变的XPC基因可有效恢复细胞中XPC蛋白的表达,该研究为很多其他皮肤病的治疗提供了新的思路。

单基因遗传病种类十分多样,对人类的健康构成了十分巨大的威胁,随着工业的发展以及有害污染物的积累,基因突变的频率大大升高,导致人群中致病基因增加。完善单基因遗传病基因编辑的治疗方法对人类的健康将会发挥重要的作用。

4.2 利用基因编辑来研究和治疗肿瘤疾病 体细胞内的基因组发生变异将会导致体细胞遗传基因组的改变,当这些遗传物质的改变积累到一定程度时将会发生癌变,这些癌变不会通过遗传传递给子代最典型的疾病就是各种癌症。

从治疗靶标上来看, CD147基因已经应用于肿瘤分子的靶向治疗。在不同肿瘤组织和正常组织中,CD147基因的表达存在着显著差异[39]。例如,在口腔鳞状细胞癌组织中,CD147的表达明显高于癌旁组织,转移癌组织中的CD147表达也显著升高,并且在CD147表达的蛋白质中有一种在口腔黏膜下纤维化中起到关键作用的跨膜蛋白,其与上皮间质转化(EMT)之间有着明显的关联,而EMT又与口腔鳞状细胞癌之间有着明显的关系,所以CD147很可能是口腔癌的潜在治疗靶向基因[49]。在小鼠基因敲除实验中,与野生型相比,敲除CD147的细胞系,其增殖和对阿霉素的抗性都明显受到抑制,根据以上的结果得以表明敲除CD147可以显著降低cal27肿瘤细胞的增殖和侵袭[39],CD147非常可能是口腔癌的潜在治疗靶标。

从宏观治疗方法上来看,新晋的癌症治疗方法,CAR-T治疗(嵌合抗原受体修饰的T细胞治疗)有着良好的效果和巨大的提升潜力。CAR-T治疗是一种是通过在T细胞的表面表达特异性受体,从而达到特异性识别、杀伤靶细胞的效果,使肿瘤失去免疫耐受。有研究人员通过CRISPR-Cas9技术构建CAR-T细胞,通过编辑TRAC基因座,将CD19特异性的CAR插入受体细胞TRAC基因组,增强了T细胞效力,延迟效应T细胞的分化和衰竭[50]。CAR-T疗法在血液肿瘤和淋巴瘤的治疗上都有很不错的效果,但价格昂贵,对实体瘤效果不佳[40]。

从肿瘤体外实验来看,动物肿瘤模型是非常好的研究对象。就肝癌来说,目前手术切除和放化疗依旧是临床治疗的主要手段,但肝癌很容易复发和转移,使得患者的预后很差,5年生存率仅有14.1%[51]。因此,肝癌的治疗研究和肝癌动物模型的建立进程刻不容缓。有研究人员通过CRISPR-Cas9技术,分别靶向编辑小鼠肝细胞的抑癌基因PTEN和P53。结果表明,3%的肝细胞同时缺失了抑癌基因PTEN和P53。3个月后,实验的所有小鼠都生成了具有特征性的肝肿瘤,该研究成功构建了肝癌的小鼠疾病模型,为肝癌疾病的研究奠定了新的研究基础[41]。

在基因编辑治疗领域,许多研究人员也致力于通过基因编辑手段建立动物癌症模型和基因根源治疗方法,这也逐渐成为了一种新的热点。

4.3 基因编辑在治疗人类线粒体疾病方面的研究 线粒体是必不可少的细胞器,它是真核细胞能量产生和细胞生长的中心结构。一般情况下,正常和突变的线粒体可以在患病细胞中共存,其中两者DNA的比例将反映疾病的严重程度。低比例的突变线粒体DNA/正常线粒体DNA可以出现在正常的表型中;当细胞中突变mtDNA(线粒体DNA)与正常mtDNA的比例超过一定值时,机体则会因一些线粒体功能异常而导致临床病症。

例如,线粒体脑肌病伴乳酸血症和卒中样发作(mitochondrial encephalopathy-lactic acidosis and stroke like episodes,MELAS)是一种多器官疾病,常伴有发育不良、身材矮小、偏头痛、癫痫、中风样发作、听力障碍等[52];肌阵挛性癫痛伴碎红纤维病的肌阵挛性癫痫的临床特征包括肌病、肌阵挛、共济失调和癫痫。这都是大量mtDNA点突变造成的疾病。从CPISPR-Cas9系统的功能和用途上来看,其很有可能解决mtDNA中的突变,但由于体积太大而无法进入线粒体基质。相反,传统的基因编辑方法似乎更适用于线粒体基因编辑。有研究人员开发了一种DddA细菌间毒素,它可以催化dsDNA中胞嘧啶脱氧核糖核苷酸的脱氨基作用。他们还融合了DddA的转录激活因子样效应阵列蛋白和尿嘧啶糖基化酶抑制剂,生成了一种不含RNA的DddA衍生的胞嘧啶碱基编辑器 (DdCBE),该编辑器可以准确地将人类mtDNA中CG转化为TA[42]。碱基编辑器的应用使精确操纵mtDNA成为可能,在治疗线粒体疾病方面具有广阔的前景。

Leber遗传性视神经病(Leber′shereditaryopticneuropathy, LHON)也是非常典型的线粒体疾病,发病原理是复合物Ⅰ的泛醌氧化还原酶亚基4上出现组氨酸和精氨酸的替换,导致线粒体呼吸链异常,细胞产生三磷酸腺苷能力显著下降。科研人员发现,构建靶向线粒体的病毒载体来实现正常mtDNA递送也是一种有效的治疗方法。研究人员将MTS肽与AAV衣壳蛋白和VP2融合,达到传递mtND4基因治疗LHON的目的,载体的基因传递效率在细胞和动物水平上得到了验证[44]。这些研究为原位线粒体的基因传递来治疗线粒体疾病提出了新的方向和参考。

目前,许多线粒体疾病都只能靠药物来缓解症状,无法从根本上治愈,并且对疾病并发症没有缓解作用,所以找到一种从根本上解决线粒体基因突变的方法尤为重要。目前很少有研究专注于原位mtDNA传递,这也是一大难题,并且线粒体基因传递效率几乎没有在人体内得到验证,因此解决线粒体基因疗法还有很多研究和实践有待完成。

4.4 基因编辑中基因敲除方法在疾病治疗中的应用 基因敲除(knock out, KO) 是利用同源重组这一特性,使受体细胞中原本表达的特定基因失活,以实现修复目标基因的研究。

前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin-9(Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9) 可以减少低密度脂蛋白(LDL) 胆固醇从血液中清除,从而导致心血管方面疾病的发病[44]。有研究表明,可以通过抑制PCSK9的表达来降低血清胆固醇,从而达到治疗心血管疾病的目的[53]。有研究人员对猴子静脉注射经过Ⅰ-CreⅠ开发的AAV8-M1PCSK9大范围核酸酶,6个月后,实验组猴子中检测到大量的肝细胞的PCSK9基因失活,与对照组相比,血液中PCSK9蛋白的表达降低约60%,LDL降低了34%[45]。这项新的发现为不能耐受抗PCSK9蛋白药物的高胆固醇血症心脏病患者增加了新的诊治方向。

脂质代谢异常也会导致心血管疾病。最近,研究人员发现,CRISPR技术可用于敲除或破坏脂肪细胞的产热抑制基因NRIP1,从而治疗糖尿病、肥胖以及胰岛素调节和脂质代谢失常的一些严重合并症,包括一些心血管疾病和脂肪肝。脂质代谢由储存脂质的白色脂肪细胞和分泌有利于脂质代谢物质的棕色脂肪细胞进行调节。将棕色脂肪注入肥胖小鼠体内可明显改善小鼠的葡萄糖耐受量,但由于人类棕色脂肪细胞含量较低,人类对于葡萄糖和脂肪相互转化的能力较低。将经过CRISPR修饰过的人或小鼠棕色脂肪细胞注入高脂饮食饲养的小鼠体内,可减少三酰甘油以及肥胖的产生,并增强葡萄糖耐受性[54]。

通过基因敲除技术可以确定特定基因的性质以及研究它对机体的影响。这对了解疾病的根源或者是寻找基因治疗的靶目标都有重大的意义。

4.5 基因编辑中基因敲入方法在疾病治疗中的应用 基因敲入(knock in, KI)与基因敲除相对应,当疾病的发生是由于体内缺乏某种物质表达的时候,基因敲入可以将关键基因转入细胞内进行同源重组从而达到从根源上治疗疾病的目的。

研究人员在遗传性酪氨酸血症成年小鼠模型中证明了注射编码腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editor, ABE)的质粒DNA和sgRNA均可以纠正A>G的位点突变。通过注射ABE和sgRNA可以产生Fah+肝细胞并改善Fah突变小鼠的体重减轻的表型[55]。该研究表明,ABE在纠正成年哺乳动物模型中,具有修复突变基因方向的潜在应用。

除了纠正疾病表型,基因敲入技术在肿瘤治疗中也有实质性的进步。有研究人员提出了一种将“自杀基因”插入基因组中从而提高癌症模型小鼠生存率的方法:研究人员通过CRISPR-Cas9技术将“自杀基因”HSV1-tk插入断裂点的位置,然后使用前体药物更昔洛韦进行处理,发现这种方法能够导致27%的肿瘤细胞死亡。这个发现使得研究人员的目光从细胞转向了患癌模型小鼠,他们将带有融合基因的肿瘤细胞移植到小鼠体内,成瘤后利用CRISPR-Cas9技术再次插入自杀基因,协同更昔洛韦对小鼠进行治疗。结果发现肿瘤大小比最高值减小了29%,并且实验过程中未发生明显的肿瘤转移和小鼠死亡的现象[56]。这项研究表明插入“自杀基因”可杀死肿瘤细胞并抑制肿瘤的生长,因此,该方法可以作为治疗一些携带融合基因的肿瘤的可行策略。

不管是基因敲入还是基因敲除技术,如何解决安全性及有效性是将来真正在患者身上应用最大的难题。

4.6 表观遗传调控在基因治疗中的应用 表观遗传调控是细胞产生不同功能的生物基础,细胞的基因和外部环境就决定了不同细胞具有各种不同且相对固定的表观调控模式。表观遗传学是指不包括DNA序列的变化基因表达的遗传变化,机制包括DNA甲基化和去甲基化、组蛋白翻译后修饰、染色质重塑等[57]。由于重编程不会在普通的体细胞中自发产生,可以把这种重编程的非自发性理解为体细胞的身份决定机制,而只有人为干预体细胞重编程的过程,我们才能了解这些机制中哪些是具有关键调控地位[58]。

有研究人员采用CRISPR-Cas系统,将MS2:P65:HSF1(MPH)转录激活复合物同改良的sgRNAs(包括截短的14-bp gRNA和MS2环)包装到腺病毒载体系统中并感染表达dCas9的转基因小鼠。通过靶向激活相应内源基因成功地改善了急性肾损伤、1型糖尿病和杜氏肌肉营养不良症(Duchenne muscular dystrophy, DMD)模型的疾病表型[59]。

综上所述,表观遗传学可以引领我们走向一个新的疾病治疗时代,从而达到预防疾病,减轻疾病影响的目的。

5 基因编辑的新策略

目前,最为广泛使用的CRISPR-Cas9基因编辑系统的工程核酸酶一直都在被推陈出新,这些新式工程核酸酶能够精确的靶向基因组操作,揭示疾病基因型和表型之间的因果关系,而无需在靶向不同序列时重新设计特定酶。CRISPR-Cas9已成功用作胚胎干细胞和患者来源的干细胞中的离体基因编辑工具,还可以用来了解胰腺β细胞的发育和功能,最新研究RNA引导的核酸酶还为生成新的糖尿病动物模型开辟了道路,并可以用来测试各种糖尿病治疗方法的有效率[60]。

在一项新的研究中,为了确定急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML) 细胞增殖过程中的关键代谢酶基因,有研究组进行了以代谢酶为靶点的CRISPR-Cas9功能基因组筛选,得到了目标AML细胞。这些目标细胞中具有吡哆醛激酶 (pyridoxal kinase,PDXK)以及负责催化维生素B6产生的磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate,PLP),后者负责促进AML细胞利用维生素B6,进而利用其产生AML增殖所需的酶和原料等。当PDXK缺失或被抑制时,AML细胞无法利用维生素B6,增殖将受到阻碍[46]。该研究表明,通过抑制PDXK或阻断维生素B6信号通路将会为治疗AML的方法提供一条新的道路。这意味着基因编辑系统不仅可以用来靶向基因,还可以利用其特质来进行基因筛选选取目标细胞来进行研究。

另外,有研究人员发现沉默子也能在基因疾病治疗中发挥作用。沉默子是一段能够结合转录调节因子的DNA序列,沉默子激活时,会阻碍RNA聚合酶转录DNA序列,进而阻碍RNA翻译为蛋白质的过程。但是在细胞的生长进程中,沉默子发挥着重要的的作用。例如,血红蛋白F(fetal hemoglobin, HbF)也就是胎儿型血红蛋白,这种血红蛋白在胎儿时期体内浓度较高,出生以后血红蛋白F浓度逐渐下降,这就和沉默子的调控有着密不可分的关系[61]。

镰刀形红细胞贫血患者红细胞内有许多镰刀状的异常血红蛋白,这些异常血红蛋白可相互结合形成长纤维状沉淀物,使红细胞发生变形,其形状如镰刀形,由于形态异常而容易发生溶血。有研究显示胎儿型血红蛋白抑制镰刀状血红蛋白聚合,自然发生的遗传性HbF能够持续性减轻疾病症状。因此,重新唤醒成年红细胞中发育沉默的HbF可以作为一种治疗策略。基因组编辑平台的进展中,特别是使用CRISPR-Cas9,通过人工创建HPFH突变、编辑转录HbF沉默子以及调节控制HbF表达的表观遗传中间体,这一想法为有效诱导HbF提供良好的借鉴和启发意义。另外,在研究BCL11A基因的临床试验中,编辑β-血红蛋白病患者的增强子已经展示出了非常有希望的结果[61]。

对于基因编辑系统内的新策略、新方法也逐渐被挖掘开发出来。在提高时间和空间可控性方面,一些使用遗传、化学和物理方法来调控 CRISPR-Cas9 活性的新兴策略取得了可喜的成果。包括细胞特异性启动子、小分子激活和抑制效应、生物性转基因载体以及光/热/超声/磁的激活[62]。CRISPR-Cas9基因编辑系统在其细胞内低传递效率减少了临床应用中的用途和效率。在最近的研究中,纳米载体、脂质体、聚合物和无机纳米粒子载体,已表现出巨大的基因传递潜力。其中纳米粒子作为CRISPR-Cas9系统传递的非病毒载体有了显著发展,也表现出了其在临床治疗应用中的良好前景[63]。

另外,一些改善脱靶、毒性问题的新策略的也有了新的发现。在基因编辑的过程中,DNA双链断裂会引起CRISPR-Cas9核酸酶的基因毒性。例如,针对珠蛋白基因的基因组编辑会诱导从珠蛋白CRISPR-Cas9切割位点到端粒(5.2 Mb)的百万碱基级杂合性(loss of heterozygosity, LOH)丢失[64]。CRISPR-Cas9还可以使活细胞中核酸的特性或丰度产生变化。为了减少脱靶效应,通过特定条件控制CRISPR-Cas9功能的工具正在积极研究中。例如,刺激响应性引导RNA (gRNA)。然而,由于缺乏一种在化学中通用的合成方法来将各种不稳定的修饰引入gRNA来触发gRNA的生理相关刺激,使得该研究在很大程度上受到限制。在最近的一项研究中,清华大学研究人员开发了一种基于2′-O-甲基核糖核苷酸硫代磷酸酯(PS-2′-OMe) 位点特异性衍生化制备刺激响应性gRNA的通用方法。研究人员分别在氧化应激和可见光触发的人类细胞中展示了利用CRISPR-Cas9进行的基因编辑。该项研究完成了一项合成方面的挑战,并为化学修饰的RNA在基因治疗中发挥更积极的作用而作出了重大贡献[65]。

因此,如何提高基因编辑的效率以及基因编辑片段的长度是许多科学家正在研究基因编辑领域新策略的方向。优化材料,实现基因编辑工具的多功能性,实现副作用最小化是寻找新的基因编辑新策略最迫切的动力。

6 技术未来的发展方向

目前,基因编辑技术未来的发展方向包括以下两点:药物的研发应用方面:开发遗传疾病和肿瘤药物的研发将会推动基因编辑技术不断向前发展。随着现代医学的进步和个体化治疗的推进,基因编辑治疗的普及、个体化将进一步发展,更多的基因编辑技术将在未来走进患者的治疗与生活。

临床治疗应用方面:如何将基因编辑技术运用于临床实践中,还有许多问题待解决,例如,怎样提高基因编辑的转染和编辑效率、减少和预测潜在的脱靶效应和毒性反应等。在实践中不确定因素的影响也会对临床治疗应用产生较大的影响,此外,这还涉及到伦理问题;没有一个单独的编辑技术是完全理想地适用于所有情况。每一项技术都有很明显的限制,但相应地也有它们各自适合应用的优点,所以需要我们运用技术优势来合理选择方案。

此外,如何扩大基因编辑的靶向范围,这对于诱导精确的HDR或NHEJ,以及实施配对切口酶等十分重要,是非常值得去努力的方向。Cas9、成对Cas9切口酶以及dCas9融合的这种靶向范围限制的主要来源于PAM序列(protospacer adjacent motif, PAM),但需要更多的实验来确定这些序列识别和切割的稳定性。研究人员还需要制定新的方法来全面评估基因组中Cas9核酸酶或配对切口酶的脱靶效应[29]。这些方法对于增强基因编辑平台的特异性和基因治疗真正意义进入临床至关重要。

7 结语

基因编辑技术的发展已经从最开始的遗传物质随机插入宿主基因组,逐步发展成为可控的非随机插入宿主机基因组的技术,是如今临床领域的非常重要的治疗方式。这期间,全世界的科研人员都在奋力发展这种兴新的新技术,为基因编辑不停地注入新鲜的血液。尽管目前基因编辑技术在疾病治疗的研究以及科研任务上还有许多难题有待解决,但随着基因编辑调控机制的研究深入和人类疾病原理的更深层次的发现,基因编辑技术在疾病治疗方面将会发挥出非常强大的能量。

利益相关声明:所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献说明:刘梓航负责起草论文框架和论文撰写,蔡祥胜负责文献的检索和查阅,杨翌负责论文的修改,孙筱放负责论文撰写过程的规划和指导,谢英俊负责对论文研究整体方向的指导规划和修改。