miR-518e在鼻咽癌中的表达及意义*

黄永塔, 李艳艳, 张力行, 张少杰, 刘霞, 叶秋容, 莫祥兰△

广西壮族自治区人民医院 1病理科, 2耳鼻咽喉头颈科(广西南宁 530021)

鼻咽癌是起源于鼻咽黏膜的恶性上皮源性肿瘤,其发生与EB病毒感染密切相关。鼻咽癌具有明显的地理分布特征,在东南亚发病率较高,我国占全球新发病例近40%,尤其好发于两广地区。由于鼻咽癌病变位置深,病变早期缺乏明显的临床症状、体征,容易发生远处转移和淋巴结转移。鼻咽癌对放疗敏感,早发现、早治疗可以延长患者生存时间。肿瘤转移与复发仍是鼻咽癌治疗失败的首要原因,也是导致鼻咽癌总体生存率较低的主要原因[1]。远处转移和淋巴结转移是鼻咽癌预后差的独立因素。因此,寻找能够准确预测鼻咽癌远处转移或淋巴结转移潜能的分子标记物,进而对鼻咽癌进行预后危险度分层,筛选出高危患者进行早期干预,有利于改善患者生存质量。莫祥兰等[2]研究证实,鼻咽癌的发生、发展与EB病毒感染导致的microRNA(miR)表达失调密切相关。本课题组前期鼻咽癌组织miR芯片筛选及小样本验证发现,miR-518e在鼻咽癌组织异常表达,表达水平呈明显上调趋势。为了进一步检测鼻咽癌miR-518e表达情况,探讨miR-518e的临床病理意义,本研究旨在检测鼻咽癌组织的miR-518e表达水平,并分析miR-518e与临床病理参数、患者预后的相关性,探讨miR-518e作为预测鼻咽癌转移潜能和临床预后分子标记物的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集我院有完整临床和病理资料的鼻咽部未分化非角化性癌60例,并收集同期鼻咽黏膜慢性炎组织15例作为对照组。纳入标准:(1)术前患者检查资料完善,有鼻咽部及颈部MRI、胸部X线/CT、腹部B超及骨扫描等相关临床检查资料;(2)活检标本均在放化疗之前取材,经10%中性缓冲福尔马林固定24 h,石蜡包埋,HE制片;(3)组织均行免疫组织化学染色和EB病毒编码的RNA(EBER)原位杂交检测;(4)由两名病理专家诊断为鼻咽部未分化非角化性癌;(5)确诊后均予常规放疗或放疗加化疗联合治疗。排除标准:临床病理资料不完善;鼻咽部鳞状细胞癌或腺癌;鼻咽部未分化非角化性癌复发就诊者;活检标本取材时挤压或烧灼变性明显。

本研究方案获我院伦理委员会批准(编号:伦理-KY-ZC-2020-008号)。

1.2 方法

1.2.1 标本采集与处理 鼻咽癌患者均在行鼻咽镜检查时应用活检钳钳取病变黏膜组织3块,对照组标本为鼻咽黏膜慢性炎患者活检组织。活检标本置于4%中性缓冲福尔马林液中固定24 h,石蜡包埋,HE制片。鼻咽活检石蜡组织行免疫组化及EBER原位杂交检测,切片均于显微镜下形态学观察,进行病理诊断。

1.2.2 实时荧光定量RT-PCR检测 采用miRNeasy FFPE kit (217504,购自Qiagen)提取人鼻咽癌组织石蜡切片总RNA;Nanodrop2000测定RNA提取液的D260吸光度值,计算纯度和浓度;使用miscript ⅡRT kit(218161,购自Qiagen)进行逆转录反应,按照试剂盒说明书进行操作。CDNA逆转录反应条件:42℃ 60 min;95℃5 min;使用SYBR Green法检测标本组织中miR-518e表达水平,用U6基因为内参基因。miR-518e上游引物序列为5′-AAAGCGCTTCCCTCTAGA-3′,U6上游引物序列为5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′,通用下游引物序列为5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。实时荧光定量PCR反应体系:正、反向引物各2 μL,cDNA模板2 μL,SYBR Green PCR Master Mix 10 μL,ddH2O补至20 μL。反应条件:(1)95℃ 15 min;(2)94℃ 15 s;(3)55℃ 30 s;(4)70℃ 34 s,(2)～(4)步骤共40个循环。

1.2.3 RT-PCR实验结果分析 实时荧光定量RT-PCR反应结束后,确认扩增曲线和溶解曲线,检测每个试验样本的阈循环(threshold cycle,Ct)值,阈循环值随模板浓度增大而减少;U6 snRNA作为实验的内参基因;ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因,ΔΔCt=ΔCt实验组目的基因-ΔCt对照组目的基因,目的基因miR-518e相对表达量以2-ΔΔCt表示。

1.2.4 随访 以电话随访或门诊复查的方式对鼻咽癌患者进行随访,随访时间60个月,记录患者的病情发展情况,以病死或出现复发、新转移病灶为随访终结。生存时间按月计算。

1.3 统计学方法 应用SPSS 25.0统计软件进行数据处理。计量资料以中位数及四分位数[M(P25,P75)]表示,组间比较采用秩和检验;2检验分析miR-518e表达强度与临床病理参数的关系;采用受试者工作特征(ROC)曲线分析miR-518e对鼻咽癌的诊断价值;以Kaplan-Meier生存曲线分析miR-518e对患者预后的影响,Log-rank检验分析两组生存率的差异;以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床病理特征 60例鼻咽癌患者,男性41(68.3%)例,女性19(31.7%)例,年龄25～81岁,中位年龄46岁,39(65%)例年龄<50岁,21(35%)例年龄≥50岁;34(56.7%)例初诊时仅发现鼻咽部原发病灶,26(43.3%)例除了鼻咽部原发病灶外,伴有肝、肺、骨等远处部位转移;14(23.3%)例初诊时未发现淋巴结转移,46(76.7%)例初诊时伴有颈部淋巴结转移;T分期:15(25%)例为T1～2期,45(75%)例为T3～4期;依据UICC(2010)分期标准进行临床分期,临床Ⅰ～Ⅱ期5(8.3%)例,Ⅲ～Ⅵ期55(91.7%)例。

2.2 miR-518e的表达水平 对照组鼻咽黏膜组织miR-518e相对表达量为1.14(0.33,3.70),鼻咽癌组织的miR-518e相对表达量为29.95(11.51,65.66)。鼻咽癌组织miR-518e异常表达上调,其表达水平是鼻咽黏膜组织26.3倍, 表达水平显著高于鼻咽黏膜组织(Z=-5.29,P=0.000)。miR-518e的表达情况见图1。

图1 miR-518e在鼻咽癌组织和对照组的表达情况

2.3 miR-518e与临床病理参数的关系 60例鼻咽癌组织不同程度表达miR-518e,相对表达量1.04～353.05,中位数为29.95。以miR-518e相对表达量中位数为截断值,将60例鼻咽癌组织分为高表达组和低表达组。miR-518e表达强度与鼻咽癌颈部淋巴结转移、远处转移均呈显著相关(2=5.96,P=0.015;2=6.79,P=0.009),而miR-518e与患者性别、年龄、T分期、临床分期均无相关性(P>0.05)。miR-518e表达强度与鼻咽癌临床病理参数的关系见表1。

表1 miR-518e表达强度与鼻咽癌临床病理参数的关系

2.4 miR-518e对鼻咽癌的诊断价值 ROC曲线分析结果显示,鼻咽癌诊断的曲线下面积为0.941(95%CI:0.885～0.997,P=0.000),敏感度为 88.35%,特异度为93.3%,提示miR-518e对鼻咽癌诊断具有一定效能。miR-518e对于鼻咽癌诊断的最佳界限值为8.40。miR-518e对鼻咽癌诊断的ROC曲线分析见图2。

图2 miR-518e对鼻咽癌诊断价值的分析

2.5 miR-518e与临床预后的关系 以miR-518e相对表达量中位数29.95为截断值,将鼻咽癌患者分为miR-518e高表达组和低表达组。60例鼻咽癌患者随访4～60个月,中位随访时间为26.5个月,37例在随访期间出现肿瘤复发或死亡。高表达组、低表达组患者中位无进展生存期(progression-free survival,PFS)分别为11.5个月、60个月。60例鼻咽癌患者5年总体生存率为41.7%,其中miR-518e高表达组、低表达组患者5年总生存率分别为30.0%、53.3%。经Log-rank检验分析,miR-518e低表达组患者5年总生存率明显高于高表达组(2=4.26,P=0.039)。鼻咽癌患者生存曲线分析见图3。

图3 miR-518e对鼻咽癌患者5年总生存率的影响

3 讨论

鼻咽癌是常见的头颈部恶性肿瘤之一。鼻咽癌早期转移、临床分期晚、缺乏治疗靶点以及放化疗的不良反应等是治疗效果不佳的主要因素。鼻咽癌患者的临床预后个体差异较大,即使是临床分期相似的患者,其生存时间仍相差较大。探索鼻咽癌远处转移、淋巴结转移发生发展的生物学机制,对具有转移潜能的鼻咽癌患者及时采取有效的干预措施,对延长鼻咽癌患者生存时间有重要意义。因此,当务之急是筛选出有助于鼻咽癌早期诊断、提高疗效、改善临床预后的分子靶标。miRNAs作为非编码性小分子RNA,在肿瘤发生、发展中发挥作用,参与调控肿瘤迁移、侵袭、黏附、上皮-间质转化、细胞外基质修饰等转移相关环节,极大地影响癌症患者的临床预后[3]。

近年来,miRNAs作为一种新的肿瘤分子标记物,引起了人们的极大兴趣[4-6]。miRNA-629在鼻咽癌细胞中表达上调,通过抑制PDCD4靶基因表达,促进肿瘤细胞增殖、转移[7]。miRNA-23b在鼻咽癌细胞中过度表达,减弱癌细胞间黏附力,增强肿瘤细胞迁移能力[8]。miRNA-34a通过SMAD4/TGF-β途径逆转上皮-间质转化,从而抑制鼻咽癌细胞侵袭和转移[9]。miR-584-5p表达失调可促进鼻咽癌远处转移,与患者临床预后密切相关[10]。miR-518e位于人类第19号常染色体,是近几年才被发现的miRNA,在多种疾病中表达失调,与肿瘤细胞增殖、迁移及耐药等均有关系。miR-518e在进行性核上麻痹中异常表达,参与多种细胞功能调控,增加疾病风险[11]。Kou等[12]的研究结果揭示,miR-518e可作为早期检测继发性伊马替尼耐药GIST的无创性生物标记物。miR-518e在多达50%肝细胞癌组织中持续性异常表达上调,其表达水平较癌旁肝组织上调约4 096倍[13-14]。Wei等[15]报道,miR-518e在膀胱尿路上皮癌中表达显著上调,可能与Wnt通路、胰岛素/IGF、PI3K和FGF等信号途径异常激活有关。

目前,中英文文献均未检索到关于miR-518e在鼻咽癌表达的研究报道。我们课题组前期研究发现,miR-518e在鼻咽癌组织呈过表达趋势。为了进一步验证miR-518e在鼻咽癌组织的表达情况,分析miR-518e与临床病理特征、患者预后的关系,我们率先检测鼻咽癌组织的miR-518e表达水平。我们的研究结果证实,miR-518e在鼻咽癌组织中表达失调,表达水平显著上调,其表达强度是对照组鼻咽黏膜组织26.3倍。不良饮食习惯、环境因素和遗传易感性等是鼻咽癌发生的潜在危险因素,鼻咽癌miRNA表达失调与EB病毒感染、多种癌基因和抑癌基因异常状态均有关系。因此,我们推测miR-518e在细胞生物学方面扮演癌基因的角色,可能是鼻咽癌发生中的早期分子生物学异常事件之一。我们的研究表明,鼻咽癌远处转移和颈部淋巴结转移组织的miR-518e表达强度较非转移组均有显著上调,揭示miR-518e不仅在鼻咽癌发生时起到重要作用,也在增强癌细胞的侵袭和迁移能力等方面发挥关键作用,与鼻咽癌远处转移和淋巴结转移密切相关。ROC曲线分析显示,miR-518e对鼻咽癌诊断的曲线下面积为0.941,诊断敏感度、特异度分别为88.35%、93.3%,提示miR-518e是临床诊断鼻咽癌较好的分子生物学指标。因此,作为具有癌基因功能的miRNAs之一,miR-518e与肿瘤大小、转移状态及脉管侵犯等临床病理特征一样,可作为鼻咽癌临床诊断及转移风险评估的分子标记物。

miR-518e异常表达上调也能够影响鼻咽癌患者的临床预后。miR-518e高表达组和低表达组患者中位PFS分别为11.5、60个月,低表达组患者5年总生存率显著高于高表达组(53.3%vs.30.0%)。miR-518e高表达组患者中位PFS短,5年总生存率相对较低,可能是由于miR-518e过表达更易于促进鼻咽癌侵袭与转移所致。通过检测鼻咽癌组织miR-518e表达情况,进而对患者进行预后危险度分层,筛选出高危患者进行早期干预,有望进一步延长鼻咽癌患者生存时间。因此,miR-518e作为鼻咽癌患者潜在的临床预后评估因子值得关注。

综上所述,miR-518e表达失调可以促进鼻咽癌发生、发展,与鼻咽癌远处转移和淋巴结转移密切相关。然而,因本实验获取的样本量有限,尤其是我们研究对象中临床早期鼻咽癌病例较少,故miR-518e在鼻咽癌的临床病理意义有待进一步扩大样本量进行验证。随着对miR-518e生物学功能及作用机制的深入研究,miR-518e有望成为预测鼻咽癌转移和临床预后的分子标记物。

利益相关声明:所有作者声明不存在任何利益冲突。

作者贡献说明:黄永塔负责研究项目选题和实验设计,负责论文撰写、修订;李艳艳参与病理资料的收集、整理,负责实验实施;张力行参与临床和病理资料汇总,采集实验数据;张少杰负责标本采集、临床资料收集;刘霞参与课题设计、病理诊断;叶秋容负责实验结果的统计分析;莫祥兰参与课题研究方案设计,审核实验结果。