基质金属蛋白酶3基因多态性与新疆维吾尔族成人慢性牙周炎的相关研究

王婷婷 马婷 单超 赵今

[摘要]目的：探討基质金属蛋白酶3（Matrix metalloproteinase3，MMP-3）1171 5A/6A基因多态性与新疆维吾尔族成人慢性牙周炎的相关性。方法：从前期流行调查组获取的墨玉县样本库中随机抽取300例颊黏膜拭子样本（分为健康对照组、轻度组以及中重度组三组，每组100例），提取DNA并采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应检测MMP-3 1171 5A/6A位点的基因型分布，使用卡方检验、Kruskal-Wallis H检验、Mann-Whitney U检验以及多分类Logistic回归分析MMP-3 1171 5A/6A基因多态性与牙周炎易感性的相关性。结果：MMP-3 1171 5A/6A的5A6A和6A6A基因型分布在健康对照组与轻度组之间、健康对照组与中重度组间比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；5A6A等位基因分布健康对照组与轻度组间的差异具有统计学意义（P＜0.05）。多分类Logistic回归分析显示，年龄＜35岁、5A/6A基因型及5A等位基因是慢性牙周炎的保护因素（P＜0.05）。结论：MMP-3 1171 5A/6A基因多态性可能与新疆墨玉县维吾尔族人群慢性牙周炎相关，但仍需要更高质量的多中心研究进一步证实。

[关键词]慢性牙周炎；基因多态性；基质金属蛋白酶3；维吾尔族；Meta分析

[中图分类号]R780.2    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2023）06-0104-04

Correlation of Matrix Metalloproteinase 3 Polymorphisms with Adults Chronic Periodontitis among Uyghur Adult in Xinjiang

WANG Tingting1，MA Ting1，SHAN Chao1，ZHAO Jin1，2

（1.Department of Dentistry and Endodontics，the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，Xinjiang，China; 2.Research Institute of Dentistry of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Urumqi 830054，Xinjiang，China）

Abstract： Objective  To investigate the correlation between matrix metalloproteinase 3 1171 5A/6A polymorphisms and adult chronic periodontitis among Uyghur adults in Xinjiang. Methods  300 buccal mucosal swab samples were randomly selected from the Moyu County sample base obtained from the previous epidemiological investigation group. DNA was extracted and polymerase chain reaction restricted fragment length polymorphism was used to detect the genotype distribution of MMP-3 1171 5A/6A. Chi-square test， Kruskal-Wallis H test， Mann-Whitney U test and multivariate Logistic regression were used to analyze the correlation between MMP-3 1171 polymorphism and periodontitis susceptibility. Results  The case-control study showed that there were significant differences in 5A6A and 6A6A genotype distribution between healthy controls and mild periodontitis and between mild periodontitis and moderate to severe periodontitis （P＜0.05）.There was also significant difference in allele frequency between healthy controls and mild periodontitis （P＜0.05）. Logistic analysis showed that age under 35 years old， 5A/6A genotype and 5A allele were the protective factors of chronic periodontitis （P＜0.05）. Conclusion  The polymorphism of MMP-3 1171 5A/6A may be related to chronic periodontitis among Uyghur adults in Moyu County of Xinjiang， but higher quality multi-center studies are still needed for further confirmation.

Key words： chronic periodontitis; polymorphism; matrix metalloproteinase 3; Uyghur nationality; Meta-analysis

慢性牙周炎（Chronic periodontitis，CP）是一种常见的多因素炎症性疾病，主要病因仍然是细菌感染，可导致牙龈炎症、牙槽骨丧失和牙齿脱落[1-2]。虽然致病微生物是疾病发生的触发因素，但疾病进展在很大程度上依赖于宿主对细菌及其代谢产物的免疫反应[3]。在CP的发病机理中，复杂的细胞因子网络参与了牙周组织的炎症和免疫反应[4]，其中，基质金属蛋白酶在牙周组织的重塑和破坏中发挥着核心作用。

MMP是一大类金属依赖性细胞外蛋白酶[5]，负责重塑和降解细胞外基质[6-7]，包括胶原蛋白、弹性蛋白、明胶、基质糖蛋白和蛋白聚糖等[8]。MMP-3是MMP家族的关键成员，具有广泛的底物特异性以及激活其他MMP的能力，其遗传变异会影响其转录水平和蛋白质产生，从而影响MMP-3的产生与表达[9]。MMP-3基因位于11q22.3号染色体，在1 171位点处插入腺嘌呤核苷酸会导致MMP-3基因启动子产生多态性，从而出现两个等位基因，一个等位基因具有五个腺嘌呤核苷酸（5A），另一个具有六个腺苷（6A）[1，10]。已有研究表明，该启动子基因多态性与MMP-3基因表达与调节有关，可能与CP的发病风险有关[9]。新疆墨玉县是少数民族聚集地，主要由维吾尔族人群构成，该地区的CP的患病率高达65.2%，由于其具有独特的文化、饮食习惯，使其CP的发生发展也具有独特性[11-12]。目前，关于MMP-3基因多态性与CP易感性的研究较少，因此，本研究拟通过病例对照研究探索MMP-3基因多态性与墨玉县维吾尔族人群CP易感性的关系，为该地区维吾尔族人群防治CP及制定治疗策略提供遗传学依据。

1  材料和方法

1.1 研究对象：本课题流行病学调查小组前期于2013年3月-2013年4月通过随机分层多阶段的抽样方法在新疆墨玉县维吾尔族成年人群进行流行病学一般检查及采集口腔颊黏膜拭子的工作，研究对象为随机抽取颊黏膜拭子样本库中的300例样本，分为轻度牙周炎组、中重度牙周炎组及健康对照组。轻度牙周炎组包含100例样本，其中男57例，女43例，平均年龄为39.58岁；中重度牙周炎组包含100例样本（中度牙周炎70例，重度牙周炎30例），其中男59例，女41例，平均年龄为52.92岁；健康对照组100例，男46例，女54例，平均年龄为29.95岁。本研究通过新疆医科大学第一附属医院伦理委员会批准（20141201-08），三组研究对象均签署了知情同意书。

1.2 纳入和排除标准

1.2.1 纳入标准

1.2.1.1 CP组：①年龄18～65岁；②维吾尔族，且三代以上均未与其他民族通婚；③口腔内不得少于14颗牙，其中包括4颗磨牙；④无明显的错牙合畸形及不良修复体等局部刺激。

1.2.1.2 健康对照组：①年龄18～65岁；②维吾尔族，且三代以上均未与其他民族通婚；③口腔卫生状况较好，牙龈正常或仅轻度炎症，无附着丧失（Attachment loss，AL），无松动牙，缺失牙小于3颗。

1.2.2 排除标准：①患有糖尿病、高血压及血液病等明显影响牙周状况的全身系统性疾病；②半年内进行全面牙周系统治疗或3個月内使用抗生素或免疫抑制剂等药物；③孕妇及全口无牙者。

1.3 CP诊断标准[13]：①轻度：牙龈有炎症和探针出血，牙探诊深度（Probing depth， PD）≤4 mm，AL为1～2 mm；②中度：PD≤6 mm，AL为3～4 mm；③重度：PD＞6 mm，AL≥5 mm。

1.4 方法

1.4.1 DNA提取：用消毒剪刀将口腔颊黏膜拭子棉絮部分剥取至离心管，根据说明书，采用口腔拭子基因组DNA提取试剂盒（天根产品DP322）提取DNA，并保存至-20℃冰箱中。

1.4.2 PCR扩增：将提取的DNA进行PCR扩增，用于扩增MMP-3 1171 5A/6A基因的引物由上海生工公司合成，MMP-3 1171 5A/6A的引物及PCR反应体系正向引物为5-GGTTCTCCATTCCTTTGATGGGGGGAAAGA，反向引物为5-CTTCCTGGAATTTCACATCACTGCCACCACT。PCR体系的总体积为25 μl，其中包括2×Taq PCR MasterMix 12.5 μl，正向引物1.5 μl，反向引物1.5 μl，DNA模板4 μl，无菌去离子水5.5 μl。将混合物混匀，离心机短暂离心3～5 s。PCR循环参数为94℃预变性5 min，94℃变性10 s，57℃退火20 s，72℃延伸30 s，35个循环，72℃终延伸5 min。PCR扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳分析证实PCR扩增成功。

1.4.3 酶切及基因多态性分析：用Tth111 I（宝日医生物技术有限公司）对PCR扩增成功的产物进行酶切反应。MMP-3-1 171 5A/6A酶切体系总体积为20μl，其中包括PCR扩增产物7μl，Tth 111 I限制性内切酶1μl，10X Buffer R缓冲液2μl，无菌去离子10 μl，置65℃水浴1 h。将DNA Marker及MMP-3 1171 5A/6A的酶切产物在经核酸染料染色的2%琼脂糖凝胶进行电泳，电泳30～40 min。使用凝胶成像仪确定其基因分型。

1.5 质量控制：所有标本均在样本库中随机抽取，样本量足够大，可减少抽样误差。用随机数字表法随机抽取10%样本作重复性实验，检测位点MMP-3 1171 5A/6A PCR结果的可靠性。实验标准化，使用定期校验的同一型号的仪器，检测方法统一，由经过训练的同一人进行检测，以控制检出偏移，避免因研究者及研究仪器所造成的误差。

1.6 统计学分析：采用SPSS 24.0软件处理数据，Hardy-Weinberg遗传平衡定律检查样本具有群体代表性，采用直接计数法统计基因频率及基因型数据，各基因型和等位基因频率的差异比较采用卡方检验（α=0.05），并计算优势比（Odds ratio，0R）及95%置信区间（95% confidence interval，95%CI）。多分类Logistic回归模型分析MMP-3 1171 5A/6A位点基因型的危险因素。检验水准为双侧α=0.05，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2  结果

2.1 一般资料分析：研究共纳入300例样本，结果显示，健康对照组、轻度牙周炎组及中重度牙周炎组年龄差异具有统计学意义（P＜0.05），说明随着年龄的增长，牙周炎的程度可能会加重；三组AL比较差异也具有统计学意义（P＜0.05），提示牙周炎的程度越重，AL可能会越大；而性别在三组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.2 病例对照研究基因型检测及统计分析：MMP-3 1171 5A/6A的基因型分为5A5A型纯合子、5A6A型杂合子及6A6A型纯合子，其PCR扩增产物全长129bp，6A等位基因无法被限制性内切酶Tth111 Ⅰ识别，5A等位基因因存在酶切位点而被分解为97bp和32bp，酶切后6A6A型纯合子电泳显示129bp一个条带，5A6A型杂合子电泳显示129bp、97bp、32bp三个条带，5A5A型纯合子显示97bp、32bp两个条带。见图1～2。

2.3 三组研究对象MMP-3 1171 5A/6A基因型及等位基因分布：三组研究对象的基因型分布频率符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律（P＞0.05）。MMP-3 1171 5A/6A的5A6A基因型分布在健康对照组与轻度组之间、健康对照组与中重度组之间的差异均具有统计学意义（P＜0.05），6A6A基因型分布在健康对照组与轻度组之间、健康对照组与中重度组之间的差异均具有统计学意义（P＜0.05），5A、6A等位基因分布在健康对照组与轻度组之间的差异具有统计学意义（P＜0.05），其余基因型及等位基因分布在三组间两两比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2～3。

2.4 病例对照研究的多因素Logistic回归分析：为了剔除混杂因素的影响，把是否患有牙周炎（0=无，1=是）作为因变量，年龄小于35岁（0=否，1=是）、性别（0=女，1=男）、各位点基因型（0=纯合野生型，1=杂合子，2=纯合突变型），等位基因（0=祖源基因，1=突变基因）作为自变量，采取Logistic回归分析方法，建立回归模型，分析以上这些因素数量之间的变化关系。结果显示年龄与CP的易感性相关，与年龄≥35岁相比，年龄＜35岁的人群的牙周炎易感性低（P＜0.05），提示年龄＜35岁是CP的保护因素，年龄越小越不容易患CP。以MMP-3的6A6A的基因型为参考对照，携带5A6A基因型的人群CP易感性低，5A6A基因型可能是CP的保护因子（P＜0.05），以6A等位基因为参考对照，5A等位基因是CP的独立保护性因子（P＜0.05）。见表4。

3  讨论

MMP-3启动子的基因多态性最早是在1995年由Ye等[14]提出的，但到目前为止，1171 5A/6A多态性对MMP3基因表达的影响的分子机制仍存在争议。例如，在冠心病和心肌梗死患者中6A等位基因與较高的MMP-3水平相关[1]。Loo等[15]的研究发现，MMP-3 1171的基因多态性可能与CP的易感性有关，5A等位基因可能会降低中国人群罹患CP的风险。而本研究的病例对照研究结果显示，MMP-3 1171位点的基因多态性在健康对照组与各CP组之间等位基因频率及各基因型分布的差异具有统计学意义，并提示5A等位基因可能会减少新疆墨玉县维吾尔族人群罹患CP的风险，这与Majumder等[16]对印度人群的研究结果相似。

结合本研究的研究结果，进一步探讨基因多态性病例对照研究而产生互相矛盾的结果的原因如下：首先，不同人群或同一人群不同民族之间对同一疾病可能具有不同的发病风险。其次，先前的研究表明MMP-1 1G/2G和MMP-3 5A/6A多态性之间存在强烈的连锁不平衡[17]，两者之间的连锁不平衡会影响相关基因的表达。再者，有研究表明MMP-3的mRNA的转录表达是由复杂机制调控的，不仅受到基因的调控，还受到细胞因子、生长因子等局部因素的影响[18]。除此之外，还有可能是因为方法学上的差异，例如样本量大小、对照组的选择及疾病诊断方法的不同造成的。

国内探索MMP-3 1171 5A/6A基因多态性与新疆墨玉县维吾尔族人群CP易感性的研究比较少，本研究比较全面地探索了MMP-3基因多态性与新疆维吾尔族人群的CP易感性之间的相关性，并比较本研究与国内外研究的结果，并进一步探讨基因多态性研究产生不同结果的原因。但是本研究也有一些局限性，Leite等[19]的研究发现，吸烟与CP的发病风险呈现显著正相关，提示吸烟可能是影响牙周炎发病的重要危险因素，但是本次的病例对照研究并未统计维吾尔族人群的吸烟状况，可能也会影响最后的实验结果。此外，本次研究并未探索MMP-3与MMP-1之间的连锁不平衡效应，从而可能忽略了这种效应对疾病易感性的作用。

综上所述，MMP-3的基因多态性可能与新疆墨玉县维吾尔人群CP的发病风险有相关性，但是仍需要进一步设计更优化的多中心研究，以更大的样本量和更多的种族来研究MMP-3基因多态性与CP易感性之间的关联，并在设计阶段需要更加完善得考虑到连锁不平衡及吸烟状况等重要混合因素的影响。由于牙周炎本质上是多因素疾病，涉及基因、环境和生活方式之间的相互作用，因此，牙周病风险基因评估对于预防CP的发生和发展，诊断和治疗策略可能是有一定价值的[20]。最后，希望在将来，使用多态性分析不仅能够识别疾病中的个体差异，而且有助于评估人类对各种疗法的反应。

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[收稿日期]2021-09-03

本文引用格式：王婷婷，馬婷，单超，等.基质金属蛋白酶3基因多态性与新疆维吾尔族成人慢性牙周炎的相关研究[J].中国美容医学，2023，32（6）：104-108.