HPLC-PDA双波长法同时测定复方富马酸酮替芬滴鼻液中富马酸酮替芬等5个成分的含量*

蔡亮亮，王钦，徐蕾，金智华，徐安保

1南通大学附属医院 药学部，南通 226001；2南京中医药大学翰林学院 药学院，泰州 225300；3南通大学附属医院 门诊部，南通226001

复方富马酸酮替芬滴鼻液为南通大学附属医院的院内自制制剂，处方组成为富马酸酮替芬1 g、盐酸麻黄碱5 g、呋喃西林0.2 g、紫苏籽油1 mL，其余为药用辅料，加水至1000 mL。临床主要用于治疗过敏性鼻炎，效果显著。该复方制剂的原质量标准仅检测富马酸酮替芬、盐酸麻黄碱、呋喃西林的含量，未检测紫苏籽油中亚麻酸、亚油酸的含量。《中华人民共和国粮食行业标准》 中报道紫苏籽油中的主要成分是亚麻酸、亚油酸，有益于人体健康[1]。因此有必要在制剂中控制亚麻酸、亚油酸的含量。目前已有文献报道采用高效液相色谱法（HPLC）分别检测富马酸酮替芬[2]、盐酸麻黄碱[3]、呋喃西林[4]、亚麻酸[5]、亚油酸[5]的含量；也有采用HPLC 法同时检测富马酸酮替芬、盐酸麻黄碱与呋喃西林的含量的报道[6]；但未见采用HPLC 法同时检测富马酸酮替芬、盐酸麻黄碱、呋喃西林、亚麻酸、亚油酸含量的报道。因此，为了全面控制复方富马酸酮替芬滴鼻液的质量，确保临床用药安全，本研究建立了HPLC-PDA 双波长法同时检测复方富马酸酮替芬滴鼻液中5 个成分的含量，并且对该方法加以验证。

1 仪器与试剂

LC-20AD 高效液相色谱仪（光电二级阵列检测器PDA，日本岛津仪器有限公司）；Cary-300 型紫外可见分光光度计（美国安捷伦科技有限公司）。富马酸酮替芬（批号100230-201904，含量99.9%）、盐酸麻黄碱（批号171241-201809，含量100.0%）、呋喃西林（批号101167-201001，含量99.4%）、亚麻酸（批号111631-202006，含量98.0%）、亚油酸（批号111622-202105，含量99.6%）购自中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇为色谱纯（德国默克公司）；其它试剂为分析纯。复方富马酸酮替芬滴鼻液（批号20220608、20220725、20220906）由南通大学附属医院制剂室提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex Luna-C18柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；检测波长205 nm、370 nm；柱温40℃；流速1.0 mL·min-1；进样量为10 μL。流动相A：0.1%磷酸水溶液-乙腈（90∶10，V/V），流动相B：乙腈；梯度洗脱（0～2 min，5%→5%B；2～20 min，5%→35%B；20～21 min，35%→95%B；21～35 min，95%→95%B；35～36 min，95%→5%B；36～45 min，5%→5%B）。在该色谱条件下，本制剂中5 种主要成分与其他相邻峰分离度应符合要求（r ＞1.5）。理论塔板数按富马酸酮替芬计算不低于5000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 按照复方富马酸酮替芬滴鼻液处方配比分别称取富马酸酮替芬、盐酸麻黄碱、呋喃西林、亚麻酸、亚油酸对照品适量，精密称定，用甲醇制成每1 mL 含富马酸酮替芬2.5 mg、盐酸麻黄碱12.5 mg、呋喃西林0.5 mg、亚麻酸1.5 mg、亚油酸0.75 mg 的储备液。精密移取上述储备液1mL，置5mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成每1mL 含富马酸酮替芬0.5mg、盐酸麻黄碱2.5mg、呋喃西林0.1 mg、亚麻酸0.3 mg、亚油酸0.15 mg 的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 精密量取复方富马酸酮替芬滴鼻液2.5 mL，置于5 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，振荡混匀。离心取上清液，用0.45 μm 滤膜过滤，即得供试品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液 按照复方富马酸酮替芬滴鼻液处方配比及制备工艺，制成不含富马酸酮替芬、盐酸麻黄碱、呋喃西林、紫苏籽油的阴性样品。再按“2.2.2”项下的方法制得阴性样品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 分别精密吸取“2.2”项下的阴性样品溶液、混合对照品溶液、供试品溶液10 μL 进样检测，记录色谱图（图1）。富马酸酮替芬、盐酸麻黄碱、呋喃西林、亚麻酸、亚油酸出峰时间分别为4.224、10.598、16.382、29.613、30.916 min，这5 个成分与相邻峰的分离度均大于1.5，表明复方富马酸酮替芬滴鼻中其它成分不干扰5 个主成分的检测，方法专属性良好。

图1 混合对照品于205 nm（A）及370 nm（B）、供试品于205 nm（C）及370 nm（D）、阴性样品于205 nm（E）及370 nm（F）HPLC图

2.3.2 线性与范围 以复方富马酸酮替芬滴鼻液5个成分在供试品溶液中的浓度为100%，考察5 个主成分在50%～150%浓度范围内的线性关系。分别精密量取“2.2.1” 项下混合对照品储备液0.5、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5 mL 置于5 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，取各溶液10 μL 进样分析，记录色谱图。以峰面积（Y）为纵坐标，浓度（X，mg·mL-1）为横坐标，进行线性回归，结果见表1。

表1 复方富马酸酮替芬滴鼻液中5 个成分的线性关系

2.3.3 溶液稳定性试验 取同一供试品溶液，室温放置，分别于0、1、2、4、6、8、12 h 取样检测，记录色谱图。结果5 个成分峰面积RSD 分别为0.28%、1.12%、1.25%、1.63%、1.75%，表明供试品溶液室温放置12 h 内基本稳定。

2.3.4 进样精密度试验 取5 个成分的混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样检测，连续测定6次，记录色谱图。结果5 个成分峰面积RSD 分别为0.56%、1.28%、0.73%、1.15%、1.65%，表明仪器精密度良好。

2.3.5 重复性试验 取同一批次复方富马酸酮替芬滴鼻液，按“2.2.2”项下方法分别制备6 份供试品溶液，按“2.2.1”项下方法分别配制2 份混合对照品溶液。精密量取供试品溶液与混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样检测，记录色谱图。按外标法以峰面积分别计算复方富马酸酮替芬滴鼻液中5个成分的含量及RSD 值。结果5 个成分的平均含量分别为1.089、4.982、0.214、0.582、0.185 mg·mL-1；RSD 分别为1.42%、1.62%、1.35%、1.71%、1.43%，这表明该方法的重复性良好。

2.3.6 中间精密度试验 按“2.3.5”项下方法另配制6 份的供试品溶液，另按“2.2.1”项下方法分别配制2 份混合对照品溶液。由不同分析人员用不同仪器，在不同日期按同法进行检测，记录峰面积，按外标法以峰面积分别计算富马酸酮替芬滴鼻液中5 个成分的含量及RSD 值。结果12 份样品中5 个成分的平均含量分别为1.036、5.051、0.209、0.592、0.187 mg·mL-1；RSD 分别为1.29%、1.17%、1.49%、1.55%、1.85%，表明该方法的中间精密度良好。

2.3.7 回收率试验 分别精密称取处方量80%、100%、120%的富马酸酮替芬、盐酸麻黄碱、呋喃西林、亚麻酸、亚油酸适量，加入“2.2.3”项下阴性样品溶液，模拟配制复方酮替芬滴鼻液；按“2.2.2”项下的方法制成供试品溶液，每个浓度各3 份。另照“2.2.1”项下方法分别配制2 份混合对照品溶液。精密量取供试品溶液与混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样检测，记录色谱图。按外标法以峰面积分别计算复方富马酸酮替芬滴鼻液中5 个成分的含量，计算回收率及RSD 值。结果见表2。

表2 复方富马酸酮替芬滴鼻液中5 个成分的回收率

2.3.8 样品检测 取3 批富马酸酮替芬滴鼻液，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，另按“2.2.1”项下方法分别配制2 份混合对照品溶液。按“2.1”项下色谱条件进样检测，记录色谱图。按外标法以峰面积分别计算5 个成分的含量。结果见表3。

表3 复方富马酸酮替芬滴鼻液中5 个成分的含量（mg·mL-1）

3 讨论

3.1 检测波长的选择

分别取富马酸酮替芬、盐酸麻黄碱、呋喃西林、亚麻酸、亚油酸对照品适量，精密称定，用甲醇分别稀释至约10 μg·mL-1，于200～400 nm 范围内扫描，紫外光谱图见图2。结果显示富马酸酮替芬、盐酸麻黄碱、亚麻酸、亚油酸在205 nm 处均有较强的响应，但是呋喃西林在205 nm 处响应弱，370 nm 处响应较强。复方富马酸酮替芬滴鼻液的处方组成中由于呋喃西林用量最小，为确保这5 种成分均能得到较好的响应，因此采用双波长（205、370 nm）同时检测本制剂中5 种成分的含量。

图2 紫外光谱图

3.2 供试品溶液制备方法的选择

复方富马酸酮替芬滴鼻液中的5 个成分，在甲醇中具有不同的溶解度，其中富马酸酮替芬、亚麻酸、亚油酸溶于甲醇；盐酸麻黄碱既溶于水，也可溶于甲醇；呋喃西林微溶于甲醇，极微溶于水。因此，为使这5 个成分均有好的溶解性，选择甲醇作为供试品溶液制备的溶剂。按处方配比计算，盐酸麻黄碱浓度约为5 mg·mL-1，呋喃西林浓度仅为0.2 mg·mL-1，浓度相差较大，若直接进样，盐酸麻黄碱进样量会超过柱容量，且峰形不好。因此，考虑对样品溶液稀释处理再进样。样品溶液用甲醇稀释2 倍后进样，盐酸麻黄碱峰形有明显改善，且其它4 个成分均可以检测到。因而，用甲醇对样品溶液稀释2倍，作为本品供试品溶液的制备方法。

3.3 流动相的选择

本试验分别考察了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.05%磷酸、乙腈-0.05%磷酸、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸6 组流动相体系，结果发现以乙腈-0.1%磷酸为流动相时，5 个成分峰形较好，且基线平稳，因此选为流动相。方法建立之初，拟采用等度洗脱的方式，结果发现亚麻酸、亚油酸在色谱柱上具有强保留的性质，这5 个成分保留值相差较大，因此考虑梯度洗脱[7]，并确定梯度洗脱程序。在此条件下，复方富马酸酮替芬滴鼻液中的5 个成分均能得到较好的分离，且保留时间适宜。