来氟米特干预类风湿关节炎大鼠代谢组学研究*

张欣亚，王碧莹，贾福康，付钰，2**

1河南中医药大学 药学院，郑州，450046；2河南羚锐制药股份有限公司，河南信阳，465550

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种进行性骨破坏的全身免疫性疾病，其临床特征为骨膜增殖和骨关节损伤[1]。流行病学调查结果表明[2]，RA 全球发病率约0.5%，且女性发病率高于男性。在我国贵州省部分地区RA 发病率高达9.2%，并具有30%～50%的致残风险[3]。现代临床研究表明[4]，RA的发生受到环境、遗传等多重因素影响，常涉及免疫细胞过度活化、免疫细胞亚群比例失衡、自身免疫炎症等现象[1]。RA 发病常伴随体内代谢紊乱。研究表明，RA 患者常出现色氨酸及磷脂代谢异常[5]，体内甾体类代谢物显著升高，出现类固醇代谢异常，而皮质类固醇的治疗能够回调甾体类代谢物的水平，使类固醇代谢趋于正常[6]。这些研究表明内源性代谢物的研究，有助于揭示RA 的发病机制，同时可辅助RA 的早期诊断及药物评测。

来氟米特是一种具有异噁唑结构的口服免疫抑制剂，临床用于治疗RA 和系统性红斑狼疮等免疫性疾病，疗效显著[7，8]。研究发现[9]，来氟米特可通过抑制线粒体中二氢乳清酸脱氢酶活性，阻碍细胞合成尿嘧啶核苷，同时阻止细胞由G1 期向S 期发展，直接抑制淋巴细胞、B 细胞等免疫细胞的增殖，发挥免疫抑制作用。但来氟米特干预疾病的体内变化过程研究尚不完善。本实验建立了牛Ⅱ型胶原（CⅡ）诱导RA 模型大鼠，利用血清代谢组学技术，监控机体在疾病状态和受到药物干预后的内源代谢物的水平变化，寻找机体在病理状态下和药物干预后差异表达的内源代谢物，探讨来氟米特干预RA的关键代谢通路，丰富来氟米特基础研究，并为RA的治疗策略和药物开发提供实验和理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

超高液相-四极杆飞行时间串联质谱（美国Agilent 公司，6546 UPLC-Q-TOF-MS 系统），Centrifuge 5810R 高速冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）。

1.2 主要药品和试剂

造模剂采用牛Ⅱ型胶原（批号20021，规格10mg/瓶）、弗氏完全佐剂（批号7001，规格5 mL/瓶）、不完全佐剂（批号7002，规格5 mL/瓶）均购自美国Chondrex 公司；来氟米特片（苏州长征-欣凯制药有限公司，国药准字H20000550，规格10 mg/片）；IL-1β、IL-6ELISA 试剂盒（杭州联科生物技术有限公司，批号EK301BHS-96、EK306HS-96）；IgG ELISA盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号EEL-R0518c96T）。

乙腈、甲醇、异丙醇为色谱级试剂（美国ThermoFisher 公司，批号A998-4、A452-4、A451-4），纯水（屈臣氏公司，规格600 mL/瓶）。

1.3 实验动物的分组、造模及给药

SPF 级Wistar 雌性大鼠，体重180～220 g，购自北京维通利华公司，动物生产许可证编号SCXK（京）2019-0009。饲养过程中大鼠自由摄食摄水，适应性喂养1 周后开始实验。实验过程符合河南中医药大学实验动物伦理要求（DWLL20210631）。

随机选取6 只大鼠为空白组，其余20 只大鼠按照文献方法[10]建立RA 模型。将完全佐剂与不完全佐剂按3∶1 比例混匀，加入CⅡ胶原，乳化完全后作为造模剂备用。于大鼠尾根部皮内注射0.15 mL造模剂完成首次免疫。首次免疫7 天后，造模大鼠尾部皮内注射0.10 mL 造模剂进行二次免疫，每天观察造模大鼠状态，根据RA 评分法细则进行评分（RA 评分达到2 分则造模成功）[11]。剔除未成模大鼠，将造模成功的大鼠随机被分为模型组和来氟米特组，每组各6 只。

将来氟米特片破碎并制成混悬液用于灌胃。按照来氟米特临床用药剂量，换算成大鼠灌胃剂量，前3 天5.25 mg·kg-1，后维持2.1 mg·kg-1，每天灌胃一次。正常组、模型组分别给予等体积0.9%生理盐水，每天灌胃一次。实验持续给药21 天。

1.4 大鼠各组关节炎肿胀度评价

本实验使用RA 评分法、排水法和游标卡尺法量化评价各组大鼠关节肿胀度。

RA 评分法：二次免疫结束后，每7 天观察一次大鼠关节外观。关节炎的严重程度采用5 级评分量表评分[12]：踝关节到整个足肿胀4分，脚趾到踝关节肿胀3分，脚趾和脚趾关节肿胀2分，脚趾小关节红斑或肿胀1分，无红斑或肿胀为0 分。每只大鼠的评分为四肢之和，最高关节炎评分为16 分。

排水重法[13]：在大鼠脚踝处使用记号笔标记一条线，以保证每次称重均在此线上。在天平上放置一个装水的烧杯，手持大鼠使其脚踝没入水中至与线平齐，此时天平示数即为大鼠关节肿胀程度。

游标卡尺法[14]：使用游标卡尺测量大鼠足底到脚踝面的高度，量化大鼠关节炎肿胀。

1.5 免疫功能测试

大鼠血清中IL-1β、IL-6 和IgG 水平测定：各组大鼠腹腔主动脉取血，并于4℃离心机中8000 r·min-1离心10 min，收集血清，-80℃冰箱保存。采用酶联免疫法测定IL-1β、IL-6 和IgG 水平，具体操作按试剂盒说明进行。

大鼠脾指数评价：实验第21 天记录大鼠体重。将各组大鼠脾脏完整取出，称量重量并记录。按照脾指数=脾重（mg）/体重（g）计算出各组大鼠脾指数。

1.6 踝关节病理切片染色

剪下各组大鼠的脚踝，剃去肌肉组织，于多聚甲醛中固定24 h，后转移至脱钙液中脱钙。脱钙完成后进行脱水、包埋、切片、HE 染色和番红固绿染色。使用显微镜对切片结果进行观察。

1.7 代谢组学分析

1.7.1 血清样品前处理 取大鼠血清100 μL，加入乙腈使蛋白沉淀完全后，置于4℃离心机13 000 r·min-1离心10 min，取上清在真空浓缩仪中干燥，加入80%甲醇-水溶液50 μL 复溶，离心10 min，取上清液进样。各组血清样品各取50 μL 混合，按照上述方法制成质量控制（quality control，QC）样品，用于实验过程中的仪器稳定性的分析。

1.7.2 代谢组学液质条件 色谱条件：色谱柱：安捷伦Proshell 120 EC18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）。以0.1%甲酸水为水相（A），乙腈为有机相（B），行梯度洗脱：0～2 min，5%B；2～3 min，5%→10%B；3～10 min，10%→20%B；10～20 min，20%→100%B；20～22 min，100%B。流速0.3 mL·min-1，自动进样器温度4℃，进样量1 μL，柱温箱温度25℃。

质谱条件：采用正、负离子模式采集质谱数据。毛细管电压3500 V（正）和4000 V（负），喷嘴电压500 V（正）和1000 V（负），鞘气流速9 mL·min-1，温度350℃；氮气流速11 mL·min-1，毛细管温度320℃，质量扫描范围50～1500 m/z。

1.7.3 代谢组学数据分析 处理完成的血清样品按照色谱质谱条件进行数据采集，利用Profinder 10.0 软件（美国Agilent 公司）对数据进行峰提取及峰对齐等处理，再运用MassHunter Profinder Profile 8.0 软件进行Frequency 筛选，得到由保留时间、峰面积和Mass 值构成的三维数据，完成后导入Simca P 14.1 软件（瑞典Umetrics 公司）进行主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial leastsquares discrimination analysis，OPLS-DA）。

首先，运用PCA 分析法对各组样品进行区分。再分别对各组进行OPLS-DA 分析，以变量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）＞1且单因素方差分析P ＜0.05 作为标准，筛选出潜在差异代谢物。再将质谱数据导入Metlin 数据库进行匹配，筛选出得分＞80 的化合物，并与HMDB、KEGG、Pubchem、Massbank 等多个在线数据库进行对比，根据二级质谱离子碎片和化学键断裂规律来推断其结构。最后，将差异代谢物输入到Metabo-Analyst 5.0 在线数据库中，利用pathway analysis 富集疾病通路，推断疾病诱发体内代谢变化及药物干预的代谢通路。

1.8 统计学方法

使用GraphPad prism 7.0 采用单因素方差分析对数据进行显著性差异分析，符合方差齐性的采用最小显著差异法（least-significant difference，LSD），不符合方差齐性的采用Dunnett's T3 法。

2 结果

2.1 各组大鼠关节肿胀评价

造模成功后，模型组大鼠出现小关节肿胀，伴有局部皮肤变红发热，随病情发展大鼠踝关节肿胀明显。病程后期，模型组大鼠关节严重肿胀，行动减少，整体呈炎症红肿状。与模型组相比，来氟米特组大鼠关节肿胀情况明显减轻，局部关节处仍伴有炎症肿胀现象（图1A）。

图1 踝关节外观状态（A）；RA 得分（B）；排水重法（C）及游标卡尺测量法（D）量化肿胀度结果（，n=6）

本实验采用RA 评分法、排水重法和游标卡尺测量法量化各组大鼠关节肿胀度（图1B～D）。实验开始14天，与空白组相比，模型组大鼠RA 得分显著上升。实验开始21天，与模型组相比，来氟米特组大鼠RA 得分开始下降（P ＜0.01），肿胀度显著降低（P ＜0.01）。以上结果说明给药后大鼠关节肿胀减轻。

2.2 各组大鼠病理切片结果

HE 染色和番红固绿染色结果（图2）显示，空白组关节边缘清晰，未见血管翳增生和关节侵蚀。与空白组相比，模型组大鼠关节处软骨增生，并侵蚀软骨及骨小梁，少量覆于软骨表面形成血管翳，骨关节被破坏，关节腔内可见炎症细胞浸润且细胞基质流失严重。与模型组相比，来氟米特组给药后在骨侵蚀和血管翳的形成上均有一定程度缓解。

图2 各组大鼠踝关节的HE 染色切片和番红固绿染色切片结果

2.3 各组大鼠脾指数分析

对各组大鼠的脾指数进行统计分析（图3）。与空白组相比，模型组大鼠的脾指数有显著增加（P ＜0.01）。与模型组大鼠相比，来氟米特组脾指数有降低趋势，但不具备统计学意义。

图3 各组大鼠脾指数结果（n=6）

2.4 各组大鼠血清中IL-1β、IL-6 和IgG 水平

与空白组相比，模型组大鼠血清中IL-1β、IL-6和IgG 含量均显著升高（P ＜0.01）。与模型组相比，来氟米特组大鼠血清中IL-1β、IL-6 和IgG 含量均显著降低（P ＜0.01）。结果见图4。

图4 各组大鼠血清中的IL-6（A）、IL-1β（B）及IgG（C）水平（n=6）

2.5 多元统计分析

将各组血清样品按照“1.7.1”项下方法处理后，经过UPLC-Q-TOF-MS 分析，得到总离子流（total ion current，TIC）图（图5）。

图5 空白组（A）、模型组（B）及来氟米特组（C）的TIC图

各组数据进行峰提取、峰对齐和峰过滤操作后，得到由保留时间、Mass 值和峰面积组成的三维数据矩阵，利用SIMCA P 14.1 软件进行多元统计分析。首先使用PCA 对各组进行无监督判别分析。在负离子模式下，模型组与给药组数据重叠性较大，说明在负离子模式下所检测化合物不能体现给药后大鼠体内内源性化合物的改变情况；而在正离子模式下，给药组和模型组有较为明显的区分（图6A），说明药物干预的内源性化合物在正离子模式下有较强的响应，其中R2X 为0.551，说明该PCA 模型可信度高。故在本论文采用正离子模式下所采集数据进行后续分析。PCA 得分图表明，QC 样品聚合良好，说明仪器在数据收集过程中稳定，数据可信。空白组、模型组和来氟米特组之间能区别开，各组的代谢轮廓存在差异。

图6 各组PCA 分析（A）；空白组和模型组的OPLS-DA分析（B）及OPLS-DA 模型验证结果（C）；模型组和来氟米特组的OPLS-DA分析（D）及OPLS-DA 模型验证结果（E）

2.5.1 差异代谢物筛选 为区分各组间的特征变量，获得组间差异信息，采用OPLS-DA 分析空白组和模型组的差异（图6B），两组数据能够明显地区分为两类，说明两组之间存在明显差异。对该模型进行200 次置换检验，检验结果如图6C 所示，Q2和R2左侧低于最右侧，且Q2交于Y 轴原点以下，说明该模型拟合结果良好，可信度高。在此模型中，R2Y和Q2Y 分别为0.997 和0.781，说明该模型的解释能力和预测能力均良好。在VIP>1 和单因素分析（P<0.05）共同筛选下，通过Metlin 等多个数据库检索鉴定，共指认出51 种与疾病密切相关的差异代谢物，具体信息见表1。为直观展示出这些差异代谢物在空白组和模型组中含量分布差异，使用热图进行结果展示（图7A）。将内源代谢物的HMDB 号带入MetaboAnalyst 5.0 在线数据库进行pathway analysis，并筛选出P<0.05 的代谢通路。结果如图7B 所示，说明牛CⅡ诱导的大鼠RA 模型可引起类固醇激素类生物合成、鞘脂代谢和嘌呤代谢的异常。

表1 疾病相关差异代谢物信息

表2 来氟米特干预类风湿关节炎疾病的内源差异性代谢物信息

图7 空白组和模型组差异代谢物热图（A）；RA 代谢通路（B）

其次，模型组和来氟米特组进行OPLS-DA 分析（图6D），自动拟合建立代谢轮廓。该模型中R2Y 和Q2Y 参数分别为0.998 和0.736，说明该模型预测能力和解释能力强。对该模型进行200 次置换检验，检验结果如图6E 所示，Q2和R2左侧均低于最右侧，且Q2交于Y 轴原点以下，说明该模型拟合结果良好，进一步判断该模型结果可信。在前期筛选的51 个疾病相关差异代谢物的基础上，根据VIP ＞1 和单因素分析（P ＜0.05）进行再次筛选。结果表明，来氟米特显著回调了14 种内源性代谢物，具体信息见表1～2。对14 个差异内源标记物在各组中的相对含量进行分析（图8）。与空白组相比，除melatonin外，其余13 个内源化合物的相对含量在模型组中显著升高，来氟米特给药后显著降低。

图8 14 种内源代谢物在各组的相对含量

2.5.2 代谢通路分析 来氟米特回调的内源化合物的HMDB 号投入Metaboanalysis 5.0 在线网站中进行通路分析，并根据impact>0 筛选。结果显示来氟米特主要调控了谷胱甘肽、半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸代谢，还参与了花生四烯酸及嘌呤的代谢网络调控，从而发挥对RA 模型大鼠的保护作用。

3 讨论

本文关节炎指数、血清指标结果均说明来氟米特对类风湿关节炎大鼠有显著保护作用。

代谢通路分析结果显示，蛋氨酸通过转硫基途径代谢产生半胱氨酸，半胱氨酸又是谷胱甘肽的合成的必需底物，这一过程是谷胱甘肽合成速率的主要限制因素[15，16]。在本实验中，S-adenosylhomocysteine 是蛋氨酸转硫基代谢途径中的重要中间产物，与空白组相比，S-adenosylhomocysteine 在模型组中含量异常升高，蛋氨酸转硫代谢途径异常，谷胱甘肽合成受到影响。谷胱甘肽代谢过程产生了大量的还原缓冲剂和抗氧化剂，维持人体细胞的正常生理活动[17]。模型组中NADPH和S-adenosylhomocysteine 含量异常升高，谷胱甘肽代谢、半胱氨酸和蛋氨酸失衡，是RA 大鼠体内氧化和抗氧化机制紊乱，细胞和组织发生氧化应激反应的重要表现。氧化应激过程伴随氧化自由基和活性氧的大量产生，同时促进关节腔内炎症反应发展。自由基可降解关节蛋白导致关节损伤[18]，活性氧会攻击细胞内的蛋白质、脂质等，导致细胞功能障碍，最终导致RA 关节损伤[19，20]。来氟米特调控半胱氨酸和蛋氨酸代谢、谷胱甘肽代谢，可缓解RA 自身免疫导致的氧化应激，减轻细胞和组织损伤。

色氨酸及其代谢产物与自身免疫疾病密切相关，人体内95%以上色氨酸经由犬尿氨酸代谢途径、5-羟色胺代谢途径代谢。在犬尿氨酸代谢途径中，色氨酸由吲哚胺吡咯2，3-加氧酶催化分解产生犬尿氨酸，后者由于其具有捕获氧自由基的特性，被称为内源抗氧化剂[21]。在5-羟色胺代谢途径中，5-羟色胺由色氨酸代谢产生，对多种免疫细胞有直接或间接作用。5-羟色胺作为melatonin 的前体，促进巨噬细胞M1 极化过程中分泌IL-6 和TNF-α 等多种炎症因子，促进破骨细胞的分化，破坏破骨细胞和成骨细胞之间的平衡，导致骨稳态失衡，造成骨破坏[22]。5-羟色胺还能刺激巨噬细胞和成熟树突状细胞释放超氧化物和多种炎症因子，加重炎症反应[23]。在模型组中，5-羟色胺代谢转化生成melatonin 途径受阻，来氟米特干预后，5-羟色胺代谢途径恢复正常，缓解关节炎症和损伤。

环磷酸鸟苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）是嘌呤代谢通路中的重要代谢产物。有实验证明，cGMP 的含量异常升高与RA 大鼠的痛敏行为如行走障碍、患侧足趾抬起等密切相关[24]。花生四烯酸及其代谢产物在RA 患者体内表达升高，并刺激RA 关节的炎症过程，介导关节破坏[25，26]。白三烯D4（leukotriene D4，LTD4）是由花生四烯酸通过5-脂氧合酶代谢产生的关键代谢物，可以增加血管的通透性，增加局部炎症关节的渗出，加剧关节损伤。LTD4 和其他炎症介质LTC4 和LTB4，可加剧RA 的疼痛反应[27]。来氟米特通过回调环磷酸鸟苷和LTD4的水平，调控嘌呤代谢和花生四烯酸代谢，对RA 的炎症和疼痛的缓解有重要意义。

本研究通过血清代谢组学，从机体在生理和病理不同状态下的内源化合物变化，阐述来氟米特干预RA 的机制。来氟米特作为免疫抑制剂，通过调控炎症和免疫反应中多种炎症因子的释放，干预谷胱甘肽、半胱氨酸、蛋氨酸、花生四烯酸、色氨酸及嘌呤代谢，发挥保护作用。代谢组学提供的病理条件下的异常代谢产物信息，可为类风湿关节炎的预防与治疗提供参考。