基于灰色关联度的金母颗粒抗炎作用的谱效关系研究

王志萍，李林杰，王昱涵，谢谭芳，冯桥，王孝勋（. 广西中医药大学，广西 南宁 50200；2. 广西高校中药制剂共性技术研发重点实验室，广西 南宁 50200；.广西国际壮医医院皮肤科，广西 南宁 50200）

壮药金母颗粒是在壮医坐浴方基础上加减而来，由9 味特色药材组成，分别是金刚刺、火炭母、大血藤、虎杖、土茯苓、白背叶根、犁头草、苦参、黄柏[1-2]。其作为一项特色的壮药新药研究项目，已完成了工艺、多组分含量测定、药效学及其作用机制等研究。药效学研究表明其可有效抑制盆腔炎性疾病后遗症（SPID）的炎症反应[2-6]。在中药及其复方制剂质量研究中，中药指纹图谱可以整体地反映中药质量，将其与药效指标相结合，建立合理的谱-效模型和分析方法，可以系统揭示中药成分与药理作用之间的关系，阐明中药的药效活性成分[6]。中药复方可通过谱效关系探究药效物质群，为质量评价研究提供新的思路[7-8]。因此，本研究通过建立金母颗粒高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，对指纹图谱进行聚类分析、主成分分析及正交偏最小二乘法分析，并通过灰色关联度将建立的指纹图谱与金母颗粒干预SPID 的作用进行关联，探究可能的有效成分群，为完善金母颗粒质量标准指标成分的选择、质量标志物的分析及其新产品的开发提供实验基础。

1 仪器与材料

LC-2030 Plus 高效液相色谱仪（岛津马来西亚工厂）；SQP 十万分之一电子天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］；UPH-IV-20TN 超纯水机（四川优普超纯科技有限公司）；PL-FS40T 康士洁超声波清洗机（东莞康士洁超声波科技有限公司）；Fresco 17离心机［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；DW-86L630 超低温冰箱（澳柯玛公司）；M200 PRO 酶标仪（瑞士Tecan 公司）。虎杖苷（批号：MUST-19062702，含量98.26%）、落新妇苷（批号：MUST-20032410，含量98.14%）、绿原酸（L-007-190829，含量98.0%），成都瑞芬思生物科技有限公司；白藜芦醇（批号：111535-201703，含量：99.4%）、大黄素（批号：110756-201913，含量：96.0%），中国食品药品检定研究院；醋酸地塞米松，南国药业有限公司；花红颗粒，花红药业股份有限公司；混合菌液，广西中医药大学微生物免疫学教研室；白细胞介素10（IL-10）试剂盒（批号：F427WLBV4P）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）试剂盒（批号：UD5XSZFQ7G），武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；甲醇为色谱纯；其余试剂均为分析纯；水为超纯水。10 批金母颗粒，广西中医药大学制剂工程中心，批号：20201004～20201213（编号：S1～S10）；方中金刚刺、火炭母、大血藤、虎杖、土茯苓、白背叶根、犁头草、苦参、黄柏等中药均于广西宝正药业有限公司购买并检定为合格，再经广西中医药大学韦松基教授鉴定，分别为拔葜科植物菝葜SmilaxchinaL.的干燥根状茎，百合科植物光叶菝葜S.glabraRoxb.的干燥根茎；蓼科植物粗毛火炭母PolygonumchinenseL.var.hispidumHook. f. 或火炭母PolygonumchinenseL.的干燥全草；木通科植物大血藤Sargetodoxa cuneata（Oliv.）Rehd. et Wils. 的干燥藤茎；蓼科植物虎杖PolygonumcuspidatumSieb. et Zucc.的干燥根茎和根；百合科植物光叶菝葜Smilaxglabra Roxb.的干燥根茎；大戟科植物白背叶Mallotusapelta（Lour.）Muell. Arg. 的根及根茎；堇菜科植物戟叶堇菜Viola betonicifoliaW. W. Sm、长萼堇菜ViolainconspicaBi及心叶堇菜ViolacordifoliaW. Beck.的新鲜或干燥全草；豆科植物苦参SophoraflavescensAit. 的干燥根；芸香科植物黄皮树PhellodendronchinenseSchneid. 的干燥树皮。金母颗粒处方的中药来源信息见表1。SD大鼠，雌性，SPF 级，体质量（200±20）g，湖南SJA实验动物有限公司，合格证号：SYXK（湘）2019-0001；饲养于广西中医药大学动物房，使用许可证号：SYXK（桂）2019-0001。

表1 10 批金母颗粒处方中药的样品信息Table 1 Source information of herbal prescriptions in Jinmu Granules

2 方法与结果

2.1 金母颗粒HPLC 指纹图谱的建立

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Shim-pack GIST C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：0.1%磷酸（A）-甲醇（B），梯度洗脱（0～30 min，10%→25% B；30～40 min，25%→34% B；40～48 min，34%→45% B；48～55 min，45%→60% B；55～90 min，60%→75% B；90～100 min，75%→80% B）；柱温：30 ℃；流速：1 mL·min-1；检测波长：306 nm；进样量：10 μL。

2.1.2 混合对照品溶液的制备 精密称取绿原酸、虎杖苷、落新妇苷、白藜芦醇和大黄素对照品适量，加甲醇溶解并稀释成质量浓度为20.1、30.15、48.24、50.25、100.5 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备[4]取金母颗粒约1 g，精密称定，置于150 mL 具塞锥形瓶中，精密加入60%乙醇50 mL，密塞，称定质量；超声（功率300 W，频率40 kHz）30 min 至完全溶解，放冷，称定；用60%乙醇补足减失的质量，用0.22 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 处方中单味中药溶液的制备 分别取处方中的单味中药适量，分别按“2.1.3”项下方法制备单味中药溶液。

2.1.5 精密度考察 取金母颗粒样品（S1），按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样，重复6 次。以共有峰13（虎杖苷）为参考峰，记录其共有峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算其RSD。结果共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD 均小于3%，说明方法精密度良好。

2.1.6 稳定性考察 取金母颗粒样品（S1），按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，分别于0、4、8、12、24、48 h，按“2.1.1”项下色谱条件进样。以共有峰13（虎杖苷）为参考峰，记录其共有峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算其RSD。结果共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD 均小于3%，说明方法稳定性良好。

2.1.7 重复性实验 取6 份金母颗粒样品（S1），按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样。以共有峰13（虎杖苷）为参考峰，计算其共有峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算其RSD。结果共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD 均小于3%，说明方法重复性良好。

2.1.8 金母颗粒HPLC 指纹图谱的建立 取10 批金母颗粒（S1～S10），按“2.1.3”项下方法依次制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析。将10 批金母颗粒色谱数据的文件格式转化为AIA，依次导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012 年版）软件；采用中位数法，时间宽度为0.1 min，以S1 为参照图谱，经多点校正后Mark 峰匹配，得到10 批样品的叠加图谱。10 批金母颗粒的叠加图中23 个共有峰均能一一对应。见图1。

图1 10 批金母颗粒的高效液相色谱指纹图谱叠加图Figure 1 HPLC fingerprint overlay of 10 batches of Jinmu Granules

2.1.9 共有峰的确定和相似度评价 将10 批金母颗粒（S1～S10）的数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012 年版）软件，选择分离度好、含量较大的23 个色谱峰作为金母颗粒的指纹图谱共有特征峰，并计算相似度。结果S1～S10 相似度分别为0.994、0.992、0.983、0.980、0.985、0.992、0.983、0.993、0.997、0.996，相似度均大于0.980，表明10 批金母颗粒主要峰群基本一致，说明金母颗粒的工艺稳定、质量一致、成分均一。

2.1.10 色谱峰指认及归属 分别取“2.1.2”“2.1.3”“2.1.4”项下的对照品溶液、供试品溶液、处方中各单味中药溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样。通过与对照品出峰的保留时间比对，可指认金母颗粒共有峰9、13、15、17、23 分别为绿原酸、虎杖苷、落新妇苷、白藜芦醇和大黄素。见图2。通过金母颗粒的各单味中药溶液的色谱图与供试品色谱图谱进行对比（见图3），将10 批颗粒指纹图谱的共有峰追溯到各单味中药。结果见表2。

图2 混合对照品溶液（A）和金母颗粒供试品溶液（B）高效液相色谱（HPLC）图Figure 2 HPLC chromatogram of mixture solution（A）and sample solution（B）of Jinmu Granules

图3 金母颗粒供试品溶液和各单味中药溶液的高效液相色谱（HPLC）图Figure 3 HPLC chromatogram of sample solution of Jinmu Granules and solution of each herb in Jinmu Granules

表2 金母颗粒中各单味中药的归属峰Table 2 Comparison table of peak attribution in each herb of Jinmu Granules

2.1.11 聚类分析（HCA） 将10 批金母颗粒的共有峰峰面积数据导入SPSS 20.0 中，先进行数据标准化处理，再采用Ward 聚类法和欧氏距离进行系统聚类分析。结果见图4。在欧氏距离＝5 时，样品可聚为4 类，S9、S10、S8 和S6 样品聚为一类，S4 单独一类，S5 和S7 聚为一类，S1、S2 和S3 聚为一类。

图4 10 批金母颗粒的聚类分析树状图Figure 4 Tree diagram of HCA for 10 batches of Jinmu Granules

2.1.12 主成分分析（PCA） 以10 批金母颗粒的共有峰峰面积数据为变量，通过SIMCA 14.1 软件进行主成分分析，对数据归一化处理后，采用自标度化法进行缩放，提取主成分，获得PCA 模型解释率参数（R2X）为0.928，预测能力参数（Q2）为0.524，表明提取的4 个主成分可解释92.8%的原始变量，模型的预测能力为52.4%。从10 批金母颗粒的PCA 得分图（见图5）可知，样品可分为4 类，且与聚类分析结果一致。说明不同批次金母颗粒化学成分的含量存在一定差异。

图5 10 批批金母颗粒的主成分分析得分图Figure 5 Principal component analysis score chart of 10 batches of Jinmu Granules

2.1.13 正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA） 为进一步研究造成10 批金母颗粒产生差异性的成分，采用OPLS-DA 模型进行分析。将10 批金母颗粒的共有峰面积数据导入SIMCA 14.1 软件中，以Pareto算法进行特征缩放，进行OPLS-DA 分析，结果显示各组金母颗粒聚集的趋势与PCA 相同（见图6）；获得相应OPLS-DA 模型，模型解释率参数R2X和R2Y分别为0.899 和0.901，表明模型对X变量的可解释率为89.9%，对Y变量的可解释率为90.1%，模型可靠[9]；采用置换检验（n= 200）对当前模型进行验证，验证参数R2=0.59，Q2=-0.887。结果见图7。Q2点的回归线与垂直轴（左侧）相交于0 以下，说明所建OPLS-DA 模型拟合良好；以变量重要性投影（VIP）筛选金母颗粒的差异化合物，VIP 值越大，对组间差异的影响越大。以VIP＞1 进行筛选[10-11]，筛选出10 个差异标志物。结果见图8。按VIP 值由大到小分别为：17 号峰（白藜芦醇）、15 号峰（落新妇苷）、10 号峰、8 号峰、5 号峰、7 号峰、11 号峰、2 号峰、14 号峰、13 号峰（虎杖苷）。这10 个峰是引起不同批次金母颗粒产生差异的主要变量。

图6 10 批金母颗粒的OPLS-DA 得分矩阵图Figure 6 OPLS- DA score matrix of 10 batches of Jinmu Granules

图7 OPLS-DA 模型的置换检验Figure 7 Permutation test of OPLS-DA model

图8 金母颗粒指纹图谱23 个共有峰的VIP 值Figure 8 VIP values of 23 common peaks in fingerprint of Jinmu Granules

2.2 金母颗粒对SPID 大鼠的抗炎作用 将150 只雌性SD 大鼠分为空白组、假手术组、模型组、醋酸地塞米松组（0.135 mg·kg-1）、花红颗粒组（2.70 g·kg-1）和10 个不同批次的金母颗粒组（2.70 g·kg-1），每组10 只。参照课题组前期研究结果[2]进行造模及给药，末次给药1 h 后进行麻醉，腹主动脉取血，静置30 min后，以3 500 r·min-1离心15 min（离心半径为8.6 cm），以50 μL 分别分装各组血清于离心管中，置于-80 ℃冰箱中保存备用。按照TNF-α 和IL-10 试剂盒说明书进行操作，经酶标仪测定吸光度值并计算血清中TNF-α 和IL-10 的含量。并用SPSS 20.0 软件进行统计分析，采用Kruskal-Wallis 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。结果见表3。与空白组比较，模型组血清TNF-α 含量显著升高（P＜0.01）；假手术组血清TNF-α 含量无显著性变化（P＞0.05）；与模型组比较，花红颗粒组和金母颗粒各组（S2、S4-S5、S7-S10）血清TNF-α 含量显著降低（P＜0.01），醋酸地塞米松组和金母颗粒组（S1、S3、S6）血清TNF-α 含量显著降低（P＜0.05）。与空白组比较，模型组血清IL-10 含量显著降低（P＜0.01）；假手术组血清IL-10含量无显著性变化（P＞0.05）；与模型组比较，花红颗粒组、醋酸地塞米松组和10 批金母颗粒组（S1-S10）血清IL-10 含量显著升高（P＜0.01）。

表3 金母颗粒对SPID 大鼠血清中TNF-α 和IL-10 含量的影响（±s，n=10）Table 3 Effects of Jinmu Granules on TNF-α and IL-10 in SPID rats（±s，n=10）

表3 金母颗粒对SPID 大鼠血清中TNF-α 和IL-10 含量的影响（±s，n=10）Table 3 Effects of Jinmu Granules on TNF-α and IL-10 in SPID rats（±s，n=10）

注：与空白组比较，△△P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别空白组假手术组模型组醋酸地塞米松组花红颗粒组金母颗粒组（S1）金母颗粒组（S2）金母颗粒组（S3）金母颗粒组（S4）金母颗粒组（S5）金母颗粒组（S6）金母颗粒组（S7）金母颗粒组（S8）金母颗粒组（S9）金母颗粒组（S10）剂量/（g·kg-1）---0.135 mg·kg-1 2.70 2.70 2.70 2.70 2.70 2.70 2.70 2.70 2.70 2.70 2.70 TNF-α/（pg·mL-1）59.07±8.70 56.90±10.01 78.39±8.52△△65.36±9.97*61.35±4.67**63.88±7.49*60.48±12.13**64.46±9.42*61.40±14.62**63.08±12.67**65.39±18.12*62.19±16.85**62.05±11.38**62.66±16.50**63.10±8.50**IL-10/（pg·mL-1）72.24±7.75 70.33±7.78 46.07±3.40△△70.03±7.46**68.66±6.11**60.54±1.68**68.34±4.97**64.63±5.29**62.01±6.70**63.57±10.39**63.19±7.69**62.32±9.95**60.44±8.04**61.35±5.06**58.61±6.41**

2.3 金母颗粒指纹图谱与其对SPID 大鼠抗炎作用的灰色关联度分析

2.3.1 实验原始数据的无量纲化处理[12]以10 批金母颗粒共有峰峰面积为比较序列，记为Ki；以金母颗粒干预大鼠SPID 后血清TNF-α 和IL-10 作为参考序列，记为Kt。将10 批金母颗粒的各共有峰峰面积和实验中大鼠血清中TNF-α 和IL-10 含量结果用灰色关联度将两者结合，进行金母颗粒对SPID 大鼠抗炎作用的谱效关系研究。因两者单位不同，不利于比较，因此用均值化法对原始数据进行无量纲化处理。计算公式为：其中为共有峰原始数据均值化后的数据，Ki（j）为第i批第j个共有峰峰面积，为第j个共有峰峰面积的平均值，Kt’ 为药效指标原始数据均值化后的数据，Ki（t）为第i批第t种炎症因子的含量，为第t种炎症因子平均含量。结果见表4。

2.3.2 计算参考序列和比较序列的灰色关联系数、关联度和关联序[12]以TNF-α 和IL-10 的含量为参考序列，以峰面积为比较序列，按下列公式计算灰色关联系数（ξ）。计算公式为：其中minΔKi(t)为第i批第j个共有峰峰面积与药效指标原始数据均值化后的数据差值的最小值， maxΔKi(t)为第i批第j个共有峰峰面积与药效指标原始数据均值化后的数据差值的最大值，ρ为分辨系数，取值为0.5。

根据公式（3）得Δ minKi(TNF-α)=0.000 2，Δ maxKi(TNF-α)=1.769 0； Δ minKi(IL-10)=0.000 2， ΔmaxKi(IL-10)=1.753 1，按公式（4）计算得灰色关联系数（ξ）。见表5 和表6。

表5 金母颗粒23 个共有峰与TNF-α 的灰色关联系数Table 5 Results of grey correlation between 23 common peaks of Jinmu Granules and TNF-α

10 批金母颗粒对SPID 大鼠血清炎症因子含量与其指纹图谱23 个共有峰的平均关联系数即为关联度，关联度按大小排序即为关联序，见表7。由10 批金母颗粒的HPLC 指纹图谱与其对SPID 大鼠抗炎作用的关联序分析可知，23 个共有色谱峰与SPID 大鼠的TNF-α 和IL-10 含量均有关联性（均大于0.6[13）]。其中关联度大于0.8 时表明有较大关联性。与SPID大鼠血清TNF-α 含量有较大关联性的色谱峰贡献大小顺序为14 号峰＞17 号峰＞15 号峰＞10 号峰＞13 号峰＞8 号峰＞6 号峰＞20 号峰＞18 号峰＞19 号峰＞4 号峰＞9 号峰＞2 号峰＞21 号峰；与SPID 大鼠血清IL-10 含量有较大关联性的色谱峰贡献大小顺序为17 号峰＞14 号峰＞13 号峰＞20 号峰＞10 号峰＞15 号峰＞6 号峰＞8 号峰＞19 号峰＞18 号峰＞23 号峰＞4 号峰＞21 号峰＞9 号峰＞16 号峰＞2 号峰。

表7 金母颗粒23 个共有峰与TNF-α 和IL-10 的关联序Table 7 Correlation sequence of 23 common peaks of Jinmu Granules with TNF-α and IL-10

3 讨论

本研究对金母颗粒HPLC 检测条件进行了优化，流动相比较了0.2%磷酸-乙腈和0.2%磷酸-甲醇，结果采用0.2%磷酸-甲醇时，金母颗粒指纹图谱基线平稳，各色谱峰分离度较好。流速比较：当流速为1.5 mL·min-1和0.5 mL·min-1时，指纹图谱共有峰15、16、17 分离度比流速为1.0 mL·min-1时差。柱温比较：35 ℃时，指纹图谱共有峰12、13、14、15、16、17 分离度比柱温为30 ℃时差，同时40～50 min 色谱峰基线变高；而柱温为25 ℃时，指纹图谱共有峰数目较少。故最终选择的色谱条件为流动相0.2%磷酸-甲醇，柱温30 ℃，流速1.0 mL·min-1。在本课题组前期研究中，供试品溶液于265、291、306、345 nm 波长处均有较大吸收[4]，在流动相为0.2%磷酸-甲醇条件下进行色谱峰对比后发现，波长为306 nm 时色谱峰信息较丰富，因此测定波长选择306 nm。

金母颗粒指纹图谱研究结果获得23 个共有峰，并指认了其中5 个共有峰，10 批样品的相似度均大于0.980，表明10 批壮药金母颗粒主要峰群基本一致。HCA 与PCA 结果一致，10 批金母颗粒均可聚为4 类；OPLS-DA 筛选出10 个差异共有峰，提示这10 个共有峰对应的成分是影响金母颗粒质量的差异性成分，其中白藜芦醇、落新妇苷、虎杖苷等经与对照品比对确认，其他差异化合物则有待进一步指认。

灰色关联度分析可知，10 批金母颗粒对SPID 大鼠抗炎作用的谱效关系中，23 个色谱峰关联度均大于0.6，表明金母颗粒可通过多成分、多靶标的途径起到抗炎作用。关联度大于0.8 时，代表该归属色谱峰与药效评价指标有较大的关联性；关联度大于0.9时，代表该归属色谱峰与药效评价指标关联性非常大[14]。白藜芦醇与TNF-α 和IL-10 的关联度均大于0.9，有非常大关联性；大黄素、虎杖苷、落新妇苷、绿原酸与TNF-α 和IL-10 关联度均大于0.8，有较大关联性。有研究[15]发现落新妇苷通过减少TNF-α来抑制T 淋巴细胞的黏附；大黄素能抑制成纤维样滑膜细胞中细胞外信号转导激酶1/2（ERK1/2）和p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）的表达，从而减轻炎症反应[16]；虎杖苷可以抑制子宫内膜炎的作用，可能与抑制核因子κB（NF-κB）信号通路有关，同时虎杖苷可能通过下调转化生长因子β1（TGF-β1）、NF-κB、P38 及促分裂原应力激活蛋白激酶（MSK）的表达水平，抑制粘连和炎症因子的表达，具有改善小鼠宫腔粘连的作用[17]；白藜芦醇可抑制TNF-α 的表达，发挥抗血管炎症作用[18]，还可通过抑制NF-κB 的表达，抑制促炎因子的表达[19]；绿原酸可抑制细胞上清液中NO 和细胞内一氧化氮合酶（iNOS）水平起到抗炎作用[20]。因此，白藜芦醇、大黄素、虎杖苷、落新妇苷、绿原酸可能是金母颗粒抗炎作用的主要药效物质基础。