葛根芩连汤含药血清对缺氧诱导HepG2 肝癌细胞糖代谢的影响及机制研究

许清松，彭程程，李冰涛，2，3，张启云，2，3，姜丽，2，3，李佳，李洋，曾治君，2，3，徐国良，2，3（.江西中医药大学中医基础理论分化发展研究中心，江西 南昌 33000；2.江西省中医病因生物学重点实验室，江西 南昌 33000；3.江西省中药药理重点实验室，江西 南昌 33000；.江西中医药大学药学院，江西 南昌 33000；.江西中医药大学岐黄国医书院，江西 南昌 33000）

2 型糖尿病（T2DM）是以胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗（IR）为病理基础的慢性代谢性疾病，属中医“脾瘅”“消渴”“肥胖”等范畴[1-2]。葛根芩连汤（GQD）源自张仲景的《伤寒论》，由葛根、黄芩、黄连、甘草4 味中药组成，具有清热燥湿功效，主治协热下利，临床上被广泛应用于T2DM 的治疗[3-4]。GQD 的降糖机制主要与其改善IR、调节糖脂代谢、抗炎、抗氧化、调节肠道菌群等有关[5-7]。研究发现，肥胖及代谢综合征患者存在慢性组织缺氧并且与IR 密切相关[8-9]；间歇性缺氧可降低小鼠全身胰岛素敏感性，增加IR 的发生风险[10-11]。缺氧可能是周身IR 形成的重要因素[12]。也有研究[13]发现，缺氧现象迟于糖耐量异常和IR 的出现，缺氧可能不是IR的启动因素，但缺氧对糖代谢的影响值得深入探讨。HepG2 肝癌细胞具有类似正常肝细胞的代谢功能，被广泛用于糖尿病药物筛选及其分子机制研究[7]。故本研究拟采用缺氧诱导HepG2 细胞糖代谢紊乱，观察GQD 含药血清对其的影响，并采用代谢组学方法探讨相关作用机制[14]，以期阐明缺氧与细胞糖代谢的关系及GQD 的干预机制。

1 材料与方法

1.1 细胞及动物 HepG2 肝癌细胞，由南昌大学重点实验室惠赠。4～5 周龄雄性SD 大鼠50 只，SPF 级，体质量（180±20）g，由江西中医药大学实验动物科技中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（赣）2018-003。动物实验经江西中医药大学实验动物伦理委员会审批，伦理批准文号：JZLLSC20220503。

1.2 药物及试剂 葛根（批号：180124）、黄芩（批号：171215）、黄连（批号：180131）、炙甘草（批号：171214），均购自江西江中中药饮片有限公司，符合《中华人民共和国药典》标准。将葛根、黄芩、黄连、甘草4 味药材按照8∶3∶3∶2 的比例称取，加入8 倍量的水浸泡30 min 后，微沸煎煮60 min，减压浓缩，得生药浓度为1.5 g·mL-1的GQD 汤剂[15]。

DMEM 高糖培养基，北京索莱宝有限公司，批号： 20201030； 0.25% 胰蛋白酶- EDTA， 美国Genview 公司，批号：09280101100；胎牛血清，上海碧艾生物科技有限公司，批号：2033119；Cell Counting Kit-8（CCK-8），北京博奥森生物技术有限公司，批号：BJ05203090；PBS 磷酸盐缓冲液（粉剂），南昌鼎国昌盛有限公司，批号：90M001140；葡萄糖测定试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号：20201003137；盐酸二甲双胍，上海麦克林生物科技有限公司，批号：M90518060；甲醇（色谱纯），美国Dikma Pure 公司，批号：9287472；甲酸（色谱纯），上海迪马科技发展有限公司，批号：2486917；乙腈（色谱纯），德国默克公司，批号：WXBD3817V。

1.3 主要仪器 CKX41 型倒置显微镜，日本Olympus公司；Smartor118 型移动式三气培养箱，宁波华仪宁创有限公司；Max Plus384 型全波长酶标仪，美国Spectra 公司；R1001-VN 型旋转蒸发仪，郑州长城科工贸有限公司；3111 型CO2培养箱、SPD131DDAP1-230 型离心浓缩系统、SL8R 型台式高速冷冻离心机、LYNX6000 型高速冷冻离心机，美国Thermo Fisher 科技公司；Waters Acquity UPLC 液相色谱系统、Q-TOF SYNAPT G2-Si 质谱仪，美国Waters公司。

1.4 GQD 含药血清制备[16]将雄性SD 大鼠适应性饲养1 周后，随机分为GQD 含药血清组及正常组，每组各25 只；每日分别灌胃25 g·kg-1GQD 汤剂或等量生理盐水，给药体积为16.7 mL·kg-1，每日分2 次灌胃，连续7 d。末次给药前12 h 禁食不禁水，给药1 h 后麻醉大鼠，腹主动脉取血，室温下静置2 h，4 ℃下以3 500 r·min-1（离心半径为13.8 cm）离心15 min，将血清分装于2 mL 冻存管，-80 ℃保存。

1.5 HepG2 肝癌细胞缺氧模型复制 将复苏后的HepG2 细胞置于含10%胎牛血清的DMEM 完全培养基中培养，待细胞传代3 次后，选择生长状态良好的细胞进行实验。细胞设置正常组和缺氧组，每组分别设置6 个复孔。正常组细胞置于37 ℃、CO2培养箱中。缺氧组细胞置于移动式三气培养箱中培养，达到缺氧条件（94% N2、5% CO2、1% O2）则开始计时。（1）分别选取5 个缺氧时间点（6、12、18、24、48 h），吸取10 μL 细胞上清液与葡萄糖试剂充分混匀；37 ℃下恒温孵育10 min 后再次混匀，吸取200 μL 混合溶液，在波长505 nm 处测定光密度（OD）值；依据试剂盒说明书方法计算细胞葡萄糖消耗量。（2）在上述5 个缺氧时间点，分别于接种细胞的96 孔板中加入110 μL 的DMEM 与CCK-8 混合液（10∶1），37 ℃下孵育1 h，在波长450 nm 处测定其OD 值，比较细胞活力。通过考察不同缺氧时间对HepG2 细胞葡萄糖消耗量和细胞活力的影响，以2 组细胞葡萄糖消耗量差异有统计学意义作为模型复制成功的标准，并确定最佳缺氧时间。

1.6 分组及GQD 含药血清干预[16]将HepG2 细胞按50×104个·mL-1的密度接种于6 孔板中，每孔2 mL；设置正常组、模型组、二甲双胍组及葛根芩连汤含药血清低、中、高剂量组，在含2% FBS 的DMEM完全培养基中培养。正常组置于常氧环境，模型组及各给药组置于1% O2缺氧环境，且每组分别设置6 个复孔。干预条件如下，正常组：15%空白血清；模型组：15%空白血清；二甲双胍组：15%空白血清+2 mmol·L-1二甲双胍；葛根芩连汤含药血清低剂量组：5% GQD 含药血清+10%空白血清；葛根芩连汤含药血清中剂量组：10% GQD 含药血清+5%空白血清；葛根芩连汤含药血清高剂量组：15% GQD 含药血清。按照“1.5”项下方法检测缺氧18 h 后各组细胞的葡萄糖消耗量及细胞活力。

1.7 细胞样品制备[7]给药干预18 h 后，各组细胞用胰蛋白酶消化后离心；收集细胞，在液氮中反复冻融破裂细胞2 次；加入-80 ℃的80%甲醇-水溶液0.5 mL，涡旋5 min；4 ℃下静置2 h，以4 ℃、15 000 r·min-1（离心半径为8.5 cm）离心10 min，取上清液真空浓缩；加入200 μL 15%甲醇-水溶液复溶，震荡5 min，以4 ℃、15 000 r·min-1（离心半径为8.5 cm）离心10 min，取上清液进行样品分析。

1.8 样品分析 色谱条件：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；柱温：40 ℃；样品室温度：10 ℃；流速：0.3 mL·min-1；进样量：2 μL；流动相A 为0.1%甲酸水，流动相B 为乙腈；梯度洗脱条件：0～2 min，99% A；2～15 min，99%～64% A；15～18 min，64%～40% A；18～20 min，40%～20% A； 20～22 min， 20% A； 22～24 min，20%～99% A。

质谱条件：电离源温度为100 ℃；锥孔气流速为50 L·h-1；去溶剂气温度为400 ℃，流速为800 L·h-1。正离子扫描模式下毛细管电压为3.5 kV，负离子扫描模式下毛细管电压为2.5 kV，锥孔电压均为40 V；正离子模式下提取锥孔电压为80 V；负离子模式下补偿电压为80 V。采集质量数范围为50～1 000 Da。采用甲酸钠标准品建立质量轴标准曲线，并利用亮氨酸脑啡肽进行实时质量校正。串联质谱碰撞气为氩气，低碰撞能为4 eV，高碰撞能为20～40 eV。

本实验使用质控样品（QC）进行方法验证，QC 样品由每个样品各取10 μL 混合而得。同一模式下，批检测时随机进行，减少误差。在进样检测前先运行5 次QC 样品平衡仪器，在检测分析过程中使用QC 样品进行稳定性考察，以确保仪器检测过程中的稳定性，同时还需在每检测8 个样品后运行一次QC样品平衡系统。

1.9 统计学处理方法及代谢组学数据分析[17]采用GraphPad Prism 8.0 统计软件进行数据分析；计量资料以均数± 标准差（±s）表示；多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）；两组间比较采用t检验；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）联用技术采集样品信息，得到样品的总离子流图；通过Progenesis QI 软件对采集得到的图谱进行峰提取、峰对齐、峰匹配和峰强度校正等处理，得到包含化合物保留时间（RT）、质荷比（m/z）及峰面积（Area）等质谱信息。应用SIMCA 14.1软件进行正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA），根据变量重要性投影（VIP）值＞1、Fold-Change≥1.3或≤0.77 及P＜0.05 筛选差异变量；通过HMDB（https://hmdb.ca） 、 KEGG （https://www.genome.jp/kegg/）在线数据库中进行代谢物鉴定，以确定GQD含药血清干预缺氧诱导HepG2 肝癌细胞的潜在生物标志物；最后，通过Metabo Analyst 5.0（https://www.metaboanalyst.ca）网站进行潜在生物标志物代谢通路分析。

2 结果

2.1 不同缺氧时间对HepG2 细胞葡萄糖消耗量及细胞活力的影响 结果见图1。与正常组比较，模型组HepG2 细胞缺氧12、18 h 的葡萄糖消耗量显著降低（P＜0.01），缺氧24、48 h 的葡萄糖消耗量显著增多（P＜0.01），缺氧6、12、18、24 h 的细胞活力无明显变化（P＞0.05），缺氧48 h 的细胞活力显著升高（P＜0.01）。故在1% O2环境下，确定缺氧18 h 作为HepG2 细胞的模型复制时间。

图1 不同缺氧时间对HepG2 细胞葡萄糖消耗量及细胞活力的影响（±s，n=6）Figure 1 Effects of different hypoxia time on glucose consumption and cell viability of HepG2 cells（±s，n=6）

2.2 GQD 含药血清对缺氧诱导HepG2 细胞葡萄糖消耗量及细胞活力的影响 结果见图2。与正常组比较，模型组HepG2 细胞的葡萄糖消耗量显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，葛根芩连汤含药血清低、中、高剂量组HepG2 细胞的葡萄糖消耗量明显升高（P＜0.05，P＜0.01）。缺氧18 h，各组间的HepG2细胞活力无明显变化（P＞0.05）。结果表明，GQD 含药血清能有效改善缺氧诱导HepG2 细胞的葡萄糖消耗量降低。

图2 葛根芩连汤（GQD）含药血清对缺氧诱导HepG2 细胞葡萄糖消耗量及细胞活力的影响（±s，n=6）Figure 2 Effects of Gegen Qinlian Decoction（GQD）-containing serum on glucose consumption and cell viability of hypoxia-induced HepG2 cells（±s，n=6）

2.3 GQD 含药血清干预缺氧诱导HepG2 细胞的代谢组学分析

2.3.1 细胞代谢轮廓分析 正、负离子模式下的总离子流图见图3。结果表明，经过峰提取、峰对齐、峰匹配和峰强度校正等处理后，各组细胞样品的UPLC-Q-TOF-MS 总离子流图轮廓基本相似，但峰响应值存在差异。

2.3.2 数据质控 基于代谢物的峰面积来计算QC 样品数据间的Pearson 相关性系数（R），范围为-1～1，QC 样品之间的相关性越高（R2越接近于1），说明在整个检测过程中稳定性越好，数据质量越高。通过3 次QC 样本数据分析得到R2在正、负离子模式下均大于0.99，结果表明仪器的稳定性较好，数据质量较高，该方法适用于检测细胞内源性物质的变化。

2.3.3 OPLS-DA 分析结果 对正常组、模型组的细胞代谢轮廓进行OPLS-DA 分析，得到正、负离子模式下的OPLS-DA 得分图（见图4-A、图4-B），结果表明正常组和模型组细胞代谢轮廓明显分离，提示缺氧诱导HepG2 细胞出现明显的代谢紊乱。对OPLS-DA模型进行验证（见图4-C、图4-D），通过重复200 次排列置换检验，Q2的回归线在纵坐标上的截距小于0，表明模型具有高度的稳健性，不存在过拟合现象。对正常组、模型组及葛根芩连汤含药血清低、中、高剂量组的细胞代谢轮廓进行OPLS-DA 分析（见图4-E、图4-F），葛根芩连汤含药血清各剂量组细胞的代谢轮廓相对远离模型组，且向正常组靠近。结果表明，葛根芩连汤含药血清可明显回调由于缺氧导致葡萄糖消耗量降低的HepG2 细胞代谢轮廓趋于正常状态。

图4 葛根芩连汤（GQD）含药血清干预缺氧诱导HepG2 细胞的OPLS-DA 分析结果Figure 4 OPLS-DA analysis of Gegen Qinlian Decoction（GQD）-containing serum intervened hypoxia-induced HepG2 cells

2.3.4 GQD 含药血清干预缺氧诱导HepG2 细胞的潜在生物标志物 结果见表1。共鉴定出缺氧诱导HepG2 肝癌细胞的潜在生物标志物12 个，其中1 个生物标志物含量显著上升，11 个生物标志物含量显著下降，而GQD 含药血清干预可使上述生物标志物明显回调。

表1 葛根芩连汤（GQD）含药血清对缺氧诱导HepG2 细胞潜在生物标志物的影响（±s，n=6）Table 1 Effects of Gegen Qinlian Decoction（GQD）-containing serum on potential biomarkers of hypoxia-induced HepG2 cells（±s，n=6）

表1 葛根芩连汤（GQD）含药血清对缺氧诱导HepG2 细胞潜在生物标志物的影响（±s，n=6）Table 1 Effects of Gegen Qinlian Decoction（GQD）-containing serum on potential biomarkers of hypoxia-induced HepG2 cells（±s，n=6）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。↓：下降；↑：升高

模式正离子负离子代谢物名称4，4-dimethyl-5alpha-cholesta-8，14-dien-3beta-ol PS[18：0/18：1（9Z）]肉桂固醇A 1，2-环氧-1，2，7，7’，8，8’，11’，12’-八氢-psi，psi-胡萝卜素PC（18：0/P-18：0）磷酸核糖甲酰胺CE[20：2（6Z，9Z）]LysoPC[22：1（13Z）/0：0]PC[14：0/22：5（4Z，7Z，10Z，13Z，16Z）]精氨酸磷酸丝氨酸二磷酸胞苷（CDP）峰面积正常组396.45±35.08 277.15±10.98 175.72±14.46 2 275.77±156.84 412.59±44.20 433.72±46.69 221.44±21.88 390.08±28.85 1 485.78±880.87 34 283.86±4 772.53 237.55±18.48 2 905.02±575.76模型组231.27±22.73**176.91±27.49**87.61±22.35**1 707.06±123.51**246.22±47.79**280.78±36.58**159.98±21.83**285.40±46.01**3 037.30±1 147.78*19 655.62±1 694.66**128.17±34.63**1 046.61±79.63**造模后变化趋势↓↓↓↓↓↓↓↓↑↓↓↓峰面积GQD 含药血清低剂量组316.23±23.55##187.77±30.33##146.57±15.83##2 541.00±183.10##402.57±56.00##440.02±47.92##240.22±25.35##483.09±67.31##4 326.76±600.45 25 855.05±4 311.23#167.64±14.10#1 676.09±101.42##GQD 含药血清中剂量组276.15±26.35#238.18±25.10##124.10±34.53 2 241.15±147.81##299.46±22.71#351.70±24.70##215.42±24.29##423.55±58.36##2 577.65±655.47 25 216.19±4 901.03#135.40±55.81 1 146.03±361.95 GQD 含药血清高剂量组246.23±57.64 164.35±50.85 100.12±24.73 1 878.22±255.70 259.14±64.28 312.35±42.51 160.56±34.80 353.57±40.01#2 320.13±558.20 23 909.63±2 656.36#91.58±30.80 863.40±79.50##给药后调节趋势↑↑↑↑↑↑↑↑↓↑↑↑

2.3.5 潜在生物标志物代谢通路分析 将上述鉴定得到的12 个潜在生物标志物导入Metabo Analyst 5.0（https://www.metaboanalyst.ca）数据库中进行代谢通路分析，结果见图5。结果表明HepG2 细胞共有9 条代谢通路发生变化，分别为甘油磷脂代谢、亚油酸代谢、α-亚麻酸代谢、花生四烯酸代谢、鞘脂代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、嘧啶代谢、嘌呤代谢以及甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢。

图5 葛根芩连汤含药血清干预缺氧诱导的HepG2 细胞的代谢通路Figure 5 Metabolicpathwayof GegenQinlianDecoction-containing serum on hypoxia-induced HepG2 hepatoma cells

3 讨论

本研究通过考察HepG2 细胞在1% O2缺氧环境下不同时间点的葡萄糖消耗量变化，确定缺氧18 h为诱导HepG2 细胞缺氧的最佳时间。与正常组比较，缺氧24、48 h 出现细胞葡萄糖消耗量显著升高的现象，可能是由于HepG2 细胞具有癌细胞属性，在缺氧环境下存在Warburg 效应，增强了细胞的无氧糖酵解[18]。糖尿病随着空腹血糖的升高，其IR 指数呈线性升高，胰岛β 细胞功能指数呈线性降低，IR与糖代谢紊乱密切相关[19]。本课题组前期研究[16]发现，3T3-L1 脂肪细胞产生IR 时葡萄糖消耗量减少，而GQD 含药血清干预具有明显改善作用。组织缺氧与IR 呈正相关[8-9]，间歇性缺氧可降低C57BL/6j 小鼠全身胰岛素敏感性及肌肉特异性葡萄糖利用率，引起小鼠IR 增强[10-11]。本实验证明，缺氧诱导18 h 可导致HepG2 细胞发生糖代谢紊乱，细胞葡萄糖消耗量显著降低。给予GQD 含药血清干预后，能够显著升高缺氧诱导HepG2 细胞的葡萄糖消耗量；进一步通过代谢组分析表明，缺氧诱导HepG2 肝癌细胞的潜在生物标志物共有12 个，而GQD 含药血清干预可使上述生物标志物明显回调。

研究[20]发现，缺氧对机体代谢物可产生明显影响，急、慢性高原缺氧均涉及磷脂代谢、鞘脂代谢、氨基酸代谢，慢性高原缺氧还可影响亚油酸代谢、花生四烯酸代谢通路。小鼠海马体和血清代谢组分析结果[21]显示，低氧可影响花生四烯酸、亚油酸、溶血磷脂酰胆碱，最终影响花生四烯酸代谢、亚油酸代谢、甘油磷脂代谢等代谢通路。本研究发现，12 个潜在生物标志物涉及甘油磷脂代谢、亚油酸代谢、α-亚麻酸代谢、花生四烯酸代谢、鞘脂代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、嘧啶代谢、嘌呤代谢以及甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢等9 条代谢通路，而GQD 含药血清干预可能通过调节上述相关通路，改善缺氧诱导HepG2 细胞的糖代谢。

磷脂具有促进脂质代谢和转运的作用，根据其取代基团的不同可分为甘油磷脂和鞘磷脂，甘油磷脂通过极性部分的不同又可以分为磷脂酰胆碱（PC）、磷酯酰丝氨酸（PS）、溶血磷脂酰胆碱（LysoPC）等[22]，可作为糖尿病诊断的重要标志物。在本研究中，缺氧导致HepG2 细胞中PS[18：0/18：1（9Z）]、PC（18：0/P-18：0）、LysoPC[22：1（13Z）/0：0]含量显著低于正常组，而PC[14：0/22：5（4Z，7Z，10Z，13Z，16Z）]含量显著高于正常组，GQD 含药血清对上述代谢物均具有回调作用。PC 是细胞的重要组成部分，主要功能是维持细胞膜的完整性，含量不足会影响细胞膜的功能及通透性，并与糖代谢密切相关。糖尿病的发生发展中常伴随着磷脂含量和种类的变化，C18：1 溶血磷脂酰胆碱和C18：2 溶血磷脂酰胆碱水平与IR 指数呈显著的负相关[23]，LysoPC 可影响糖代谢动态平衡[24]，与本研究结果相符。研究发现，糖尿病性心肌病患者的PC 水平较正常组降低[23]，在糖尿病肾病小鼠中也存在着PS[18：1（9Z）/18：1（9Z）]水平显著降低的现象[25]。提示缺氧引起细胞糖代谢异常的同时可能还伴随着磷脂代谢的异常。通过代谢通路富集分析显示，PC 参与亚油酸代谢、α-亚麻酸代谢、花生四烯酸代谢和甘油磷脂代谢。亚油酸、α-亚麻酸及花生四烯酸与T2DM 的糖脂代谢密切相关[26-30]。PC、PS和LysoPC 都涉及甘油磷脂代谢，而甘油磷脂代谢紊乱则会影响T2DM 的进程[31]。CE[20：2（6Z，9Z）]（胆固醇二十碳二烯酸）属于胆固醇酯类物质，由脂肪酸和醇作用生成，参与鞘脂代谢。在初期诊断的T2DM患者体内CE 水平显著下降，导致脂代谢紊乱[24]。CE含量的下降也提示HepG2 细胞在缺氧条件下发生脂代谢异常。本研究结果表明，GQD 含药血清可能通过调节脂质代谢改善缺氧引起的HepG2 细胞糖代谢异常。

磷酸丝氨酸参与半胱氨酸和蛋氨酸代谢及甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，磷酸核糖甲酰胺、CDP在体内分别参与嘌呤代谢及嘧啶代谢。研究发现，嘧啶代谢会影响肝脏脂质积累[32]，CDP 主要存在于线粒体、细胞核和细胞质中，缺氧可能影响HepG2 细胞的能量代谢过程。嘌呤、嘧啶代谢循环影响糖尿病的发生发展[33]，胞苷影响磷脂的合成，引起肾血流动力学发生变化，进而引发糖尿病或糖尿病肾病[34]。课题组前期研究[16]发现，GQD 含药血清可通过干预嘌呤代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢调节3T3-L1 脂肪细胞的糖代谢。本研究结果表明，GQD 含药血清可能通过调节氨基酸代谢、嘌呤及嘧啶代谢改善缺氧引起的HepG2 细胞糖代谢异常。

综上所述，GQD 含药血清可能通过调节脂质代谢、氨基酸代谢、嘌呤及嘧啶代谢来改善缺氧引起的HepG2 细胞糖代谢异常，提高葡萄糖消耗量。本研究可为从缺氧角度探讨GQD 对T2DM 的作用机制提供参考。