泡腾沉淀法制备呋塞米纳米晶的工艺及药剂学特性*

冯锁民,赵子齐,张佳欣,李惠民,郭惠辉,薛 颖,朱文璟,姚天骄,时培月

(1.西安医学院 药学院,陕西 西安 710021;2.商洛职业技术学院,陕西 商州 726000;3.陕西医药控股集团 山海丹药业股份有限公司,陕西 西安 710075)

呋塞米(furosemide),又名呋喃苯胺酸,俗称速尿,化学名称为2-[(2-呋喃甲基)氨基]-5-(氨磺酰基)-4-氯苯甲酸,分子式C12H11ClN2O5S,相对分子质量约为330.75,熔点为208～213 ℃。呋塞米为白色或白色结晶性粉末,无臭味,溶于丙酮、甲醇、二甲基甲酰胺,略溶于乙醇,不溶于水[1]。呋塞米为强效利尿药,临床上用于心衰、水肿、高血压及高钙血症等的治疗[2]。呋塞米属于生物药剂学分类系统(BCS)的Ⅳ类药物[3],低渗透性和低溶解性限制了其溶出速率和生物利用度的发挥。研究报道的增加呋塞米水中溶解度的方法有与碱成盐[1,4-5],用β-环糊精进行包合[6-7],制成固体分散体等[8-10]。另一种策略是通过降低呋塞米原料的粒径,增加微粒的比表面积以改善其溶出性能。其中纳米晶体技术(纳米混悬液)因载药量高,生物相容性好,便于工业化生产,受到普遍关注。中国有关呋塞米纳米晶研究未见相关文献报道,国外仅有学者报道采用介质研磨技术[11]、抗溶剂沉淀技术[12]和喷雾闪蒸(SFE)技术[13]制备呋塞米纳米晶。作者建立了一种新颖的泡腾沉淀技术用于呋塞米纳米晶的制备,通过单因素及正交设计优化实验条件,用HPLC法测定呋塞米纳米晶的载药量及体外溶出度。该研究为进一步设计和开发呋塞米新制剂,改善其溶出度,提高生物利用度,提供实验和理论参考依据。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

呋塞米原料药:质量分数99.59%,批号2018 0312,武汉远成科技公司;呋塞米对照品:质量分数99.3%,批号100544-201503,中国食品药品检定研究院;呋塞米纳米晶:批号20190426,20190427,20190428,自制;碳酸钠:分析纯,郑州派尼化学试剂厂;水:娃哈哈纯净水,市售;甲醇:色谱纯,广东光华科技股份有限公司;聚乙烯吡咯烷酮-30(PVPK30)、羟丙甲基纤维素(HPMC):上海化学试剂公司;泊洛沙姆188:药用级,沈阳药科大学制药厂;十二烷基硫酸钠(SDS)、氢氧化钠:分析纯,天津市天力化学试剂有限公司;磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、冰乙酸:分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司。

激光粒度仪:Malvern Zetamaster ZEN-3600,英国马尔文仪器有限公司;高效液相色谱仪(HPLC):Agilent 1260,色谱柱:Agilent HC-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm),美国安捷伦科技公司;智能药物溶出试验仪:D-800LS,天津市天大天发科技有限公司;磁力搅拌器:DF-101S,河南佰泽仪器有限公司;电子天平:FA1004B,上海越平科学仪器有限公司;高频数控超声波清洗器:KQ-300TDB,昆山市超声仪器有限公司;超低温冰箱:-86 ℃,青岛海尔;冷冻干燥机:FD-1,郑州长城科工贸有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 单因素考察呋塞米纳米晶的制备

参照药物纳米晶制备的溶剂-反溶剂沉淀法[12-14],结合呋塞米呈弱酸性的性质,采用碱性溶液作为溶剂溶解,酸性溶液作为反溶剂沉淀进行制备,并对各种条件下制备的呋塞米纳米晶用马尔文激光粒度仪测定平均粒径和多分散指数(PDI)作为评价指标进行评价。

取相同量的呋塞米(约40 mg)加入到碱性溶液中使其溶解,在水浴25 ℃、250 W超声条件下,将该溶液用注射器按一定速度注入到含有稳定剂(约40 mg)的0.1 mol/L稀盐酸溶液中,维持15 min,即得呋塞米纳米晶。

1.2.1.1 碱性溶剂的筛选

以PVPK30为稳定剂,0.1 mol/L稀盐酸溶液为反溶剂,分别用氢氧化钠溶液、碳酸钠溶液、碳酸氢钠溶液溶解呋塞米原料,用注入法制备呋塞米纳米晶,测定所制纳米晶的平均粒径和PDI。

1.2.1.2 稳定剂种类的筛选

取呋塞米的碳酸钠溶液,用注入法分别加入到含有不同种类稳定剂(约40 mg)PVPK30、SDS、泊洛沙姆188、HPMC、m(PVPK30)∶m(泊洛沙姆188)=1∶1的稀盐酸溶液,超声搅拌制备呋塞米纳米晶,测定所制纳米晶的平均粒径和PDI。

1.2.1.3 制备温度的筛选

以碳酸钠溶液为溶剂,稀盐酸溶液为反溶剂,PVPK30为稳定剂,用注入法分别在3、25、40 ℃制备呋塞米纳米晶,并测定所制备纳米晶的平均粒径和PDI。

1.2.1.4 制备仪器的筛选

为了考察所选仪器对制备呋塞米纳米晶的影响,将呋塞米溶解在碳酸钠溶液中,注入到含有稳定剂PVPK30的稀盐酸溶液中,分别采用磁力搅拌器和高频数控超声波清洗器制备呋塞米纳米晶,分别测定所制纳米晶的平均粒径和PDI。

1.2.2 正交实验优化呋塞米纳米晶的制备工艺参数

根据单因素筛选结果,分别以m(药物)∶m(稳定剂)(A)、呋塞米药物溶液的注入时间(B)、V(溶剂)∶V(反溶剂)(C)、超声时间(D)为因素,设计四因素三水平正交实验,见表1,并按正交实验制备呋塞米纳米晶。

表1 正交实验因素水平表

1.2.3 HPLC法测定呋塞米纳米晶的溶出度

1.2.3.1 色谱条件

色谱柱为Agilent HC-C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),流动相为甲醇-φ(冰醋酸)=3%水溶液(体积比为45∶55),检测波长为271 nm,流速为1.0 mL/min,柱温为30 ℃,进样量为20 μL。

1.2.3.2 溶液的配制

(1)呋塞米对照品溶液的配制。精密称取呋塞米对照品适量于容量瓶中,加流动相溶解,制成质量浓度1.02 mg/mL呋塞米对照品的储备液。

(2)呋塞米原料药溶液的配制。精密称取呋塞米原料药20 mg,置100 mL容量瓶中,加流动相振摇溶解,过滤,精密吸取续滤液5 mL于100 mL容量瓶中,加流动相稀释成质量浓度10 μg/mL的溶液。

(3)呋塞米纳米晶溶液的配制。精密称取呋塞米纳米晶冷冻干燥粉末25 mg于50 mL容量瓶中,加流动相振摇溶解,过滤,精密吸取续滤液0.4 mL于10 mL容量瓶中,加流动相稀释成质量浓度20 μg/mL的溶液。

1.2.3.3 方法学考察

(1) 线性关系。精密吸取呋塞米对照品储备液1 mL于25 mL容量瓶中,用流动相稀释至刻度摇匀,再分别精密吸取1、2、3、4、5、6 mL于10 mL容量瓶,加流动相稀释至刻度,充分摇匀。按照1.2.3.1色谱条件分别进样20 μL进行测定,记录呋塞米的峰面积(A),与进样的ρ(呋塞米)进行线性回归,得线性方程。

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(2)精密度、稳定性、重复性、加样回收率实验按相关方法进行操作。

1.2.4 呋塞米纳米晶载药量测定

取1.2.2制备的3批呋塞米纳米晶,分别进行冷冻干燥,取冷冻干燥的呋塞米纳米晶适量,照1.2.3.2(3)配制溶液,按1.2.3.1色谱条件平行进样3次,记录峰面积,代入线性方程,计算载药量。

1.2.5 呋塞米溶出度测定

呋塞米的溶出度测定采用桨法,参照文献[15]及2020版中国药典[1,16]的操作方法。以磷酸盐缓冲液(pH=5.8)900 mL为溶出介质,介质温度控制在37 ℃,转速为50 r/min。分别取相当于20 mg呋塞米质量的原料药、冷冻干燥的纳米晶、原料药与确定比例稳定剂的混合物,各平行5份于溶出杯中,启动溶出仪。t=0、5、10、15、30、45、60 min,分别取溶液5 mL,用0.22 μm的微孔滤膜滤过,取续滤液2 mL作为供试品溶液,同时每次取样后补加5 mL空白溶出介质。按1.2.3.1 色谱条件测定,计算累积溶出度,绘制溶出曲线。

2 结果与讨论

2.1 呋塞米纳米晶制备单因素筛选结果

2.1.1 碱性溶剂筛选结果

不同碱溶剂制备的呋塞米纳米晶的平均粒径和PDI见表2。

表2 不同碱溶液制备的呋塞米纳米晶的平均粒径和PDI1)

由表2可知,采用碳酸钠溶液作为碱性溶剂,制备的呋塞米纳米晶PDI较小,混悬体系最稳定,平均粒径与碳酸氢钠溶液接近,因此,选用碳酸钠溶液作为碱性溶剂制备呋塞米纳米晶。分析原因可能是反应过程中产生的CO2气体阻止了新生成纳米晶的聚集,促进纳米晶的分散,从而比无气体产生的氢氧化钠溶液具有较小的平均粒径和PDI,同时制备过程中生成的氯化钠是人体本身具有的内源性物质,不需要除杂。为了区别于酸碱沉淀法,相关文献也未见报道,称该方法为泡腾沉淀法。

不同稳定剂制备的呋塞米纳米晶的平均粒径和PDI见表3。

表3 不同稳定剂制备的呋塞米纳米晶的平均粒径和PDI1)

由表3可知,PVPK30作为稳定剂制备的呋塞米纳米晶平均粒径和PDI最小,因此,选择PVPK30为制备呋塞米纳米晶的稳定剂。

2.1.3 制备温度筛选结果

不同温度下制备的呋塞米纳米晶的平均粒径和PDI见表4。

表4 不同温度下制备的呋塞米纳米晶的平均粒径和PDI1)

由表4可知,温度对呋塞米纳米晶制备的影响不显著,但室温25 ℃制备的呋塞米纳米晶平均粒径和PDI最小。

2.1.4 制备仪器筛选结果

不同仪器制备的呋塞米纳米晶的平均粒径和PDI见表5。

表5 不同仪器制备的呋塞米纳米晶的平均粒径和PDI(n=3)

由表5可知,超声波清洗器制备的呋塞米纳米晶比磁力搅拌器具有更小的平均粒径和PDI,分析原因是超声波借助分子间的振动,阻止了纳米晶的聚集,使得形成的纳米晶粒径更小,稳定性更高,而磁力搅拌形成漩涡,进行圆周运动,不利于纳米晶的分散。

2.2 正交实验结果

按正交实验设计制备呋塞米纳米晶,测得的平均粒径和PDI见表6。按表7的评价标准进行打分,以平均粒径得分(Y1)和PDI得分(Y2)为评价指标,分别赋予权重系数0.6和0.4,计算综合评分值Y=Y1×60%+Y2×40%,并用正交助手软件进行数据处理。方差分析结果见表8。

表6 L9(34)正交实验结果

表7 平均粒径和PDI评价标准

表8 加权方差分析表

由表6和表8可知,影响因素顺序为C>D>A>B,这些因素对呋塞米纳米晶的平均粒径和PDI的影响没有显著性差异,优化的处方为A1B1C2D2,即m(呋塞米原料药)∶m(PVPK30)=1∶1,注入时间10 s,V(溶剂)∶V(反溶剂)=1∶20,超声时间15 min。优化的制备工艺为取呋塞米40 mg溶于3 mLc(碳酸钠)=0.5 mol/L溶液中,将该溶液用注射器在10 s内注入到溶有40 mg PVPK30的60 mLc(盐酸)=0.1 mol/L溶液中,从注入开始计时,在25 ℃水浴中,于250 W的超声功率搅拌15 min。

2.3 正交实验结果的验证

按2.2正交实验结果,试制的3批呋塞米纳米晶样品平均粒径和PDI比较接近,结果见表9,表明正交实验优化的参数和制备工艺比较合理,质量稳定,重复性好。

表9 正交实验结果验证

2.4 HPLC测定呋塞米含量的方法学考察结果

线性方程为A=59.886ρ-40.821(R2=0.998 8),即ρ(呋塞米)=4.08～24.48 μg/mL与吸收峰面积线性关系良好。呋塞米的HPLC图见图1。

t/min

精密度、稳定性、重复性、加样回收率实验中呋塞米的RSD值分别为0.72%、1.18%、0.96%、1.04%,平均加样回收率为98.45%,表明该方法稳定、可行。

2.5 呋塞米纳米晶载药量测定结果

3批呋塞米纳米晶的载药量测定结果见表10。

表10 呋塞米纳米晶的载药量测定结果(n=3)

由表10可知,平均载药量约为56.33%,表明正交实验优化的呋塞米纳米晶的制备参数重复性好,制备工艺稳定。

2.6 呋塞米纳米晶溶出度测定结果

不同类型呋塞米的溶出曲线见图2。

t/min

由图2可知,相同时间内,累积溶出度关系为呋塞米纳米晶>呋塞米原料药与稳定剂PVPK30的物理混合物>呋塞米原料药。t=30 min,呋塞米纳米晶的累积溶出度约为呋塞米原料药的2倍多,同时100%溶出,达到了中国药典和美国药典的要求[15],而原料药只溶出了45%,达不到药典要求,说明呋塞米制成纳米晶后其溶出速率和溶出度明显提高。虽然稳定剂PVPK30能加快呋塞米的溶出速率,但不能改变其最大溶出度。

3 结 论

研究以碳酸钠为泡腾源,稀盐酸为反溶剂,聚乙烯吡咯烷酮-30(PVPK30)为稳定剂,t=25 ℃,超声15 min的条件下,采用泡腾沉淀法优化的条件制备的呋塞米纳米晶平均粒径为218.7 nm,PDI为0.248,平均载药量为56.33%,体外溶出度高于呋塞米原料药2倍。表明泡腾沉淀法相比其他方法制备的呋塞米纳米晶具有较小的平均粒径和PDI,其累积溶出度显著提高。