参蛤散对斑马鱼血管生长的干预作用

石秀娟,魏易洪,郑 望,曹 敏,邓 兵,苑素云,周 端,唐靖一

参蛤散,原名独圣饼子,最早见于北宋《圣济总录》中,由人参和蛤蚧两味药物组成,主治“肺气咳嗽,面肿,四肢浮”[1]。前期临床研究显示,参蛤散可改善慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)病人心功能,从而改善胸闷、气促等临床症状[2],提高心室收缩功能,降低血清N末端脑钠肽前体(NT-proBNP)及脑钠肽(BNP)水平[3-4]。基础研究显示,参蛤散可改善压力负荷性心力衰竭大鼠的心功能及血流动力学指标[5-6]。上述研究结果说明参蛤散具有较好的抗心力衰竭作用。心力衰竭是心脏结构、功能的异常改变,由多种原因导致,最终发生心室收缩、舒张功能障碍,主要表现为呼吸困难、劳累、乏力及液体潴留等[7]。《中国心血管病报告2018》显示,我国心力衰竭病人约450万例,患病率随年龄增加而显著升高,住院病死率约为4.1%[8],是临床常见的慢性疾病。促进心肌血管生长,延缓病人病程发展,增强心脏功能,是治疗心力衰竭的重要研究方向[9]。本研究观察参蛤散对斑马鱼血管生长的干预作用,探讨参蛤散是否可促进血管生长,从促进血管生长方面探讨参蛤散改善心力衰竭的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 转基因斑马鱼(fli1a-EGFP),由上海中医药大学附属龙华医院斑马鱼实验室提供,温度(28.5±1)℃,循环水饲养,饲养方法参照相关文献[10]。

1.2 实验药物 参蛤散是由中药生晒参和蛤蚧组成,购自上海雷允上药业有限公司(人参批号:130705,蛤蚧批号:XD13121605)[2]。蛤蚧去头足,按照生晒参与蛤蚧按3∶1质量比例混匀后制成参蛤散[6]。参蛤散水煎液的配制:加入生药质量体积10倍的蒸馏水;大火煎煮至沸腾;沸腾后转小火,微沸浓缩;至一定体积后,再次加入等体积的蒸馏水;大火煎煮沸腾后,小火浓缩至1 g/mL。

1.3 实验试剂及仪器 内皮细胞生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(VEGF receptor kinase inhibitor Ⅱ,VRI)购自美国Sigma公司,在二甲基亚砜(DMSO)中溶解,配制成100 mmol/L储备液,-20 ℃冰箱储存。Olympus BX50显微镜:日本Olympus公司。28.5 ℃培养箱由德国Heraues公司提供。

1.4 方法

1.4.1 参蛤散水煎液干预斑马鱼正常血管生长的作用 取成熟期健康斑马鱼3对或4对,雌雄比例为1∶1或1∶2,放入带隔板的交配缸中,次日清晨08:00抽去隔板,10:00观察产卵情况,并收集斑马鱼交配产下的受精胚胎,使用胚胎培养液培养于培养皿中,置于28.5 ℃孵化箱中培养。24 h后,观察斑马鱼胚胎培养情况,选择状态良好的胚胎,显微镜下使用镊子去除胚胎卵壳,胚胎培养液稀释参蛤散水煎液至100 μg/mL、30 μg/mL、10 μg/mL和3 μg/mL,按照每孔1 mL加入24孔板中,正常组加入胚胎培养液(每孔1 mL),按照每孔至少8条,将斑马鱼幼鱼置于装有培养液的24孔板中。继续在28.5 ℃孵箱中培养至24 h,清洗加药孔,重新加入培养液及对应浓度的药液,继续培养24 h后观察肠下静脉,方法参照相关文献[10]。

1.4.2 参蛤散水煎液干预VRI损伤后斑马鱼节间血管的作用 选择状态良好、28.5 ℃孵化箱培养至24 h的斑马鱼胚胎,显微镜下使用镊子剥开胚胎卵壳后,按照每孔至少8条,将斑马鱼幼鱼放入装有胚胎培养液(每孔1 mL)的24孔板中。在胚胎培养液中加入VRI至浓度45 μmol/L,再用已加入VRI的培养液稀释参蛤散水煎液至100 μg/mL、30 μg/mL、10 μg/mL和3 μg/mL,将培养液作为正常组,加入VRI的孔为VRI组,置入28.5 ℃孵箱中培养至24 h后观察脊背节间血管,方法参照相关文献[10]。

1.5 观察指标 将药物干预后的斑马鱼置于载玻片上,除去多余水分,采用荧光显微镜观察正常斑马鱼模型的肠下静脉直径(使用Image J软件测量)、平均出芽数(出芽数/该组斑马鱼数)、平均交叉数(交叉数/该组斑马鱼数);观察斑马鱼血管损伤模型的脊背节间血管的完整型血管(intact vessels)与缺陷型血管(defective vessels)个数,方法参照相关文献[10]。

2 结 果

2.1 参蛤散水煎液对斑马鱼肠下静脉的影响 参蛤散各浓度组肠下静脉平均出芽数、平均交叉数及血管直径与正常组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表1、图1。

图1 参蛤散水煎液对斑马鱼肠下静脉的影响(→表示血管出芽;表示血管交叉)

表1 参蛤散水煎液对斑马鱼肠下静脉的影响

2.2 参蛤散水煎液对VRI损伤后斑马鱼节间血管的影响 与正常组比较,VRI组参蛤散各浓度组完整型血管减少(P<0.01),缺陷型血管增多(P<0.01);与VRI组比较,参蛤散各浓度完整型血管增多(P<0.01),缺陷型血管减少(P<0.01)。参蛤散3 μg/mL组完整型血管数最多(P<0.01),缺陷型血管数最少(P<0.01)。详见表2、图2。

图2 参蛤散水煎液对斑马鱼节间血管的影响(→表示血管损伤)

表2 参蛤散水煎液对斑马鱼节间血管的影响(±s) 单位:条

3 讨 论

心力衰竭是各种心脏疾病的终末阶段,引起病人活动耐量和生活质量下降,由于心脏射血功能减弱,同时造成人体其他器官血液灌注不足,从而引发其他系统疾病。中医药对心力衰竭有较好的治疗效果。参蛤散是由中药人参与蛤蚧组成,方中人参大补元气,蛤蚧补肺、纳气平喘,有补肺肾、定喘嗽之功。在“心肺同治”“异病同治”的中医理论指导下,周端教授率先将参蛤散用于心力衰竭的治疗,并取得好的临床疗效[4]。基础研究显示,参蛤散有较好的抗氧化[11]、抗心肌纤维化[12]等作用,具体的作用机制有待进一步探索。

在心力衰竭的研究中,干预血管生长是一个重要方向。血管新生是指在受到组织缺氧或创伤等刺激时,从已有的血管系统中形成新血管[13]。血管新生有助于心肌梗死后微循环的重建,通过促血管新生,抑制心肌重构是防治心力衰竭的研究热点[14]。血管内皮生长因子(VEGF)是研究较多的一种血管生成因子,在血管生成过程中发挥重要作用[15],该过程涉及诸多促血管生成因子,如血管生成素-1、血管生成素-2等[16]。通过磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)通路,VEGF和血管生成素-2在代偿性心肌肥厚阶段表达增加,继而提高心肌组织内毛细血管密度;心力衰竭代偿期,阻断VEGF生成时,心肌组织内毛细血管密度降低,心脏收缩功能下降,心功能提前进入心脏的失代偿期[17]。Friehs等[18]分析缩窄新生兔的主动脉,建立心肌肥厚模型,采用外源性VEGF和基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂(GM6001)干预后,在心肌肥厚阶段,外源性VEGF与其引起的MMP-2激活可促进微血管生成,从而延缓心力衰竭进程。Sano等[19]通过缩窄主动脉,建立小鼠心力衰竭模型,结果显示,血管生长抑制剂(TNP-470)抑制了小鼠心肌肥厚,加速了心功能进入失代偿期,VEGF和血管生成素-1可改善心功能,延缓心功能进入失代偿期。

斑马鱼是一种较好的模型生物,广泛应用于生物、环境等各领域中。前期研究使用转基因斑马鱼进行研究,发现人参水煎液不能促进斑马鱼正常血管生长,但较低浓度时可抑制VRI诱导的血管损伤[10],但西洋参和红参水煎液在斑马鱼正常血管生长模型及VRI诱导的血管损伤模型中均可促进斑马鱼血管生长[20-21]。蛤蚧是参蛤散中的另一组成药物,前期研究发现,蛤蚧水煎液不能促进斑马鱼的正常血管生长,但对VRI诱导损伤血管具有保护作用,且蛤蚧尾效果更好[22]。

本研究使用了参蛤散水煎液,将人参和蛤蚧配伍后进行水煎液的配制,使用转基因斑马鱼模型。结果表明,参蛤散不能促进斑马鱼的正常血管生长,但可抑制VRI对血管的损伤作用。若将人参换为红参或西洋参,结果能否改变需进一步研究。本研究结果提示,参蛤散可能通过上调VEGF发挥促进血管生长的作用,而VEGF可能与PI3K/Akt通路密切相关。Zhou等[23]研究显示,舒心饮可促进斑马鱼血管新生,可能与VEGF/PI3K/Akt/MAPK信号通路有关。

综上所述,参蛤散具有促血管生长的作用,该作用可能是参蛤散抗心力衰竭的机制之一,具体的调控机制有待进一步深入研究。