复方幺川调免消瘰颗粒的制备与鉴别及促小鼠脾淋巴细胞体外增殖的研究

陈跃玲,陈一川,罗 婷,王艳梅,陈 霞,范光忠,郭步伐,杨德志,孙成新

(1.毕节医学高等专科学校,贵州 毕节 551700;2.遵义医科大学 药学院,贵州 遵义 563099;3.毕节市中医院,贵州 毕节 551701)

瘰疬最早出现于《黄帝内经》的《灵枢·寒热》篇:“寒热瘰疬在于颈腋者,皆何气使生?”“此皆鼠瘘寒热之毒气也,留于脉而不去者也”[1]。瘰疬是一种常见的、慢性的感染性外科疾病,多生长于颈部,累累如串珠,历历可数。该病在体弱儿童或青年女性中尤为常见,多因肺肾阴虚,肝气久郁,虚火内灼,炼液为痰,或受风火邪毒侵扰,痰火结于颈 、项、腋、胯之间而成[2-5]。瘰疠前期气血两虚,后期阴虚火旺,免疫力低下。前期治则疏肝养血、理气化痰,后期滋阴降火、补气健脾,调节免疫力。复方幺川调免消瘰颗粒为临床医生的经验方。该方由黄芪、太子参、山药、白术、茯苓、猫爪草、皂角刺等十几味药材组成。方中君药黄芪、太子参具有补气健脾,增强免疫功效,猫爪草、皂角刺等疏肝清热,解毒消肿、破瘀散结为臣药,佐药银柴胡、青蒿以及牡蛎能清虚热、除疳热以及滋阴,建曲、山楂与麦芽等具有消食化积 、健脾开胃之功效,使药甘草能清热解毒并调和诸药。该方临床多用于治疗瘰疬和小儿免疫功能调理。经过30多年临床实践,在中医院从组方至今,累计病例30 000余次。该方在逆转小儿瘰疬病情发展、消除临床症状体征、改善精神饮食状况、增强免疫功能(包括滥用抗生素致免疫功能低下者)等方面疗效确切[6-8]。本文对复方幺川调免消瘰颗粒制备工艺、薄层鉴别以及该复方颗粒对小鼠脾淋巴细胞在体外增殖的影响进行实验研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试药、试剂 黄芪、太子参、白术、山药、猫爪草、皂角刺、青蒿等药材由毕节市碧水星苑健康阿鹿诊所有限公司提供,由遵义医科大学生药学教研室杨建文主任鉴定,均符合《中华人民共和国药典》2020版一部规定;黄芪甲苷对照品(批号:Yz081320)、甘草对照药材(批号:121626-201803)、皂角刺对照药材(批号:121210-201504)由中国食品药品检定研究院提供;复方幺川调免消瘰颗粒(实验室自制);去黄芪颗粒样品、去甘草颗粒样品、去皂角刺颗粒样品(实验室自制);磷酸盐缓冲液(PBS,北京索莱宝科技有限公司);RPMI 1640培养基(兰杰柯科技有限公司);动物脾淋巴细胞分离提取试剂盒(碧云天生物技术有限公司);CCK-8试剂盒(碧云天生物技术有限公司);脂多糖(LPS,Sigma公司);无水乙醇、甲醇、三氯甲烷、二氯甲烷、石油醚(60～90℃)、乙醚、乙酸乙酯、环己烷、甲酸等均为分析纯(天津市富宇精细化工有限公司);薄层层析硅胶板(青岛海洋化工)。

1.1.2 实验动物 清洁级雄性昆明小鼠,6～8周龄,体重16～20 g,购买于重庆腾鑫生物技术有限公司,实验动物使用许可证号:生产SCXK(渝)2017-0007。

1.1.3 主要仪器 SQP分析天平(赛多利斯);CM-RO-C2实验室超纯水仪(宁波丹斯博顿);JET-6000冷冻干燥机(恒诺利兴);DZF-250真空干燥箱(郑州长城科工贸);HYDJ20L煎药机(天津华延园);KQ-500DV数控超声波清洗器(昆山市超声仪器);FRESCO17冷冻高速离心机(Thermo);WCI-180二氧化碳培养箱(BIO-RAD);800TS酶标仪(BioTek)。

1.2 方法

1.2.1 提取方法 采用水提工艺,以水为溶剂提取药材有效成分,料液比使用20∶1(v/w)、10∶1(v/w)以及5∶1(v/w)煎煮提取3次,分别为3、2、1 h,合并提取滤液,浓缩并冷冻干燥成粉末状。

1.2.2 湿法制粒工艺正交实验设计 把上述提取的冻干粉与一定比例的可溶性淀粉混匀,加入0.5%阿斯巴甜矫味剂,将乙醇作为润湿剂制软材,以“手握成团,轻压即散”为标准,2号药筛挤压过筛制粒,60 ℃烘干,即得。

采用正交实验法筛选制粒工艺,以成型率、吸湿率以及休止角三者作为评价指标,考察可溶性淀粉与原料配比、乙醇浓度以及乙醇用量3个因素,每种因素选择3个参考水平,设计L9(33)正交表进行正交实验,通过方差分析评价出最优成型工艺。成型工艺优化正交实验设计见表1。

表1 成型工艺优化正交实验设计

1.2.3 指标测定

1.2.3.1 成型率 按2020年版《中国药典》四部0104颗粒剂项下粒度检查法[9]进行测定,收集通过1号筛而不能通过5号筛的合格颗粒,称重,过筛前颗粒质量记为m1,合格颗粒质量记为m2,并计算成型率。成型率计算公式:成型率(%)=m2/m1×100%。

1.2.3.2 吸湿率 按照文献操作[10],在干燥器内放入适量的过饱和氯化钠溶液,密封48 h,将复方幺川调免消瘰颗粒置于称量瓶中,厚约2 mm,精密称定颗粒重为m1′,置于60 ℃烘箱中干燥至恒重,然后将称量瓶瓶盖打开后置于干燥器内于48 h后精密称定吸湿后的颗粒重记为m2′,根据以下公式计算吸湿率:吸湿率(%)=( m2′-m1′)/ m1′×100%。

1.2.3.3 休止角 将3只漏斗串联并固定于水平放置的坐标纸上方3 cm高处,将颗粒从最上方漏斗靠壁处小心倒入,坐标纸上的颗粒圆锥体顶部接触到下端漏斗口为止,测出坐标纸上圆锥体底部的直径(2 r),设颗粒圆锥体高度为H,计算休止角(tan α),平行测定3次,取平均值。计算公式为:tan α=H/r。

1.2.4 成型工艺验证方法 按照上述正交实验确定的最优制粒工艺平行制备3批颗粒剂,分别测定成型率、吸湿率与休止角。

1.2.5 薄层色谱研究

1.2.5.1 甘草 ①称取复方幺川调免消瘰颗粒细粉10 g,置于具塞锥形瓶中,加入50 mL石油醚(60～90 ℃),超声30 min(超声功率20 000 Hz),将溶液4 000 r/min离心10 min,挥干石油醚。加入50 mL甲醇,超声提取60 min(超声功率20 000 Hz),分液漏斗过滤,滤液减压蒸干,加入10 mL氨试液溶解残渣,转移至分液漏斗,加入20 mL水饱和正丁醇溶液进行萃取,收集正丁醇层,重复萃取3次,合并醇层,减压浓缩蒸干,加入2 mL甲醇溶解制样备用;②称取去甘草颗粒样品细粉10 g,置于具塞锥形瓶中,加入50 mL石油醚(60～90 ℃),超声30 min(超声功率20 000 Hz),后续同法处理;③称取甘草对照药材2 g,加入20 mL石油醚(60～90 ℃),超声30 min(超声功率20 000 Hz),后续同法处理;④用毛细管各取上述3种溶液5 μL,分别点于同一硅胶G板上,以三氯甲烷-甲醇-水(12.5∶6.5∶2)的下层溶液为展开剂进行展开,晾干后喷以10%硫酸乙醇溶液,在105 ℃烘箱内加热至斑点显色清晰。在日光和365 nm紫外光下观察。

1.2.5.2 皂角刺 ①称取复方幺川调免消瘰颗粒细粉10 g,置于具塞锥形瓶中,加入50 mL二氯甲烷,超声60 min(超声功率20 000 Hz),分液漏斗过滤,滤液减压蒸干,加入1 mL甲醇溶解制样备用。②称取去皂角刺颗粒样品颗粒细粉10 g,置于具塞锥形瓶中,加入50 mL二氯甲烷,超声60 min(超声功率20 000 Hz),分液漏斗过滤,滤液减压蒸干,加入1 mL甲醇溶解制样备用。③称取皂角刺对照药材2 g,加入20 mL二氯甲烷,超声60 min(超声功率20 000 Hz),分液漏斗过滤,滤液减压蒸干,加入1 mL甲醇溶解制样备用。④用毛细管各取上述3种溶液5 μL,分别点于同一硅胶G板上,以环己烷∶乙酸乙酯(7∶3)为展开剂进行展开,晾干后喷以10%硫酸乙醇溶液,在105 ℃烘箱内加热至斑点显色清晰。在日光和365 nm紫外光下观察。

1.2.6 小鼠脾淋巴细胞增殖实验 ①现杀取小鼠脾脏组织,称重,磨碎并用150目尼龙纱布过滤,离心获得小鼠脾淋巴细胞;②将分离好的小鼠脾淋巴细胞用1640培养基调整密度至1×106个/ mL,于96孔培养板中培养,每孔100 μL细胞悬液,除空白组外,每孔加入终浓度为20 μg/mL的LPS,培养条件为37 ℃,5%CO2培养箱中;③用不含血清的1640培养基将复方幺川调免消瘰颗粒细粉浓度配制成5、10、20、40、80、160 、320、640、1 280 μg/mL,分别将不同浓度的复方颗粒加入到小鼠脾淋巴细胞中,每个浓度设置5个重复孔,另设置1组空白对照组和LPS对照组,同样条件培养72 h;④向培养48 h的细胞培养板中每孔加入20 μL CCK-8,放入培养箱中反应3 h,用酶标仪在450 nm波长处测定其吸光度值。

2 结果

2.1 成型工艺优化正交实验设计分析 按照以下公式计算综合评分:

综合评分=[(成型率/最大成型率)/3+(最小吸湿率/样品吸湿率)/3+(最小休止角/休止角)/3]×100。

对颗粒成型工艺优化正交实验进行极差与方差分析。根据测定结果的综合评分进行极差分析,优化出最佳成型工艺为A2B2C2,即可溶性淀粉与提取冻干粉用量1∶1, 使用70%的乙醇,乙醇占冻干粉的重比为50%,正交实验方案分析与方差分析结果分别见表2、表3。

表2 正交实验方案分析

表3 综合评分的方差分析

2.2 成型工艺验证 利用筛选出的最优制粒工艺平行制备的3批颗粒剂,检测得到成型率(%)、吸湿率(%)、休止角(°)。 结果显示筛选优化得到的制剂成型工艺稳定可行(表4)。

表4 验证试验结果(n=3)

2.3 薄层色谱鉴定结果

2.3.1 甘草 在可见光与365 nm紫外光下观察可以看到,供试品薄层色谱在对应位置上,与甘草对照药材显示相同的黄色斑点与黄色荧光斑点,且去甘草阴性对照无此斑点。结果如图1所示。

A:日光灯下观察;B:365波长紫外光下观察;1:复方颗粒;2:去甘草阴性复方颗粒;3:甘草对照药材。图1 复方幺川调免消瘰颗粒甘草薄层鉴别

2.3.2 皂角刺 在可见光与365 nm紫外光下观察可以看到,供试品薄层色谱在对应位置上,与皂角刺对照药材显示相同的紫色斑点与黄色荧光斑点,且去甘草阴性对照无此斑点。结果如图2所示。

A:日光灯下观察;B:365波长紫外光下观察;1:复方颗粒;2:去皂角刺阴性复方颗粒;3:皂角刺对照药材。图2 复方幺川调免消瘰颗粒皂角刺薄层鉴别

2.4 小鼠脾淋巴细胞增殖实验 通过图3实验结果可以看出,与空白组比较,复方幺川调免消瘰颗粒对LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞48 h增殖影响是随着浓度增大OD值逐渐增加,但当浓度到达一定程度时(40 μg/mL),OD值不再增加,当高于640 μg/mL时OD值反而下降,这可能是复方幺川调免消瘰颗粒在一定浓度范围内具有促进LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖的作用(P<0.01,n=5),但当浓度增大到一定值时,因为某些组分的存在反而抑制了小鼠脾淋巴细胞增殖。

A:复方幺川调免消瘰颗粒对LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖影响的OD值变化;B:复方幺川调免消瘰颗粒对LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞活力影响;**:与CON组相比,P<0.01;n=5。图3 复方幺川调免消瘰颗粒对LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞48 h增殖影响

3 讨论

淋巴细胞是机体进行免疫应答的重要细胞,多聚集于脾脏,其活化、增殖、分化对免疫应答过程十分重要,可以通过增加脾脏淋巴细胞数来提高机体的免疫功能。LPS是B淋巴细胞的有丝分裂原,本项目使用LPS诱导小鼠脾细胞分化B淋巴细胞,检测幺川调免消瘰颗粒对小鼠脾淋巴细胞增殖,从而反映其对免疫调节水平的影响[11]。瘰疠(淋巴结核)的发病与免疫互为因果,当机体免疫功能减弱时,可导致内源性感染复发而发病,进一步抑制免疫功能。儿童时期,尤其是婴儿时期脏腑娇嫩,卫外不固,易于发生脾胃疾病、肺系疾病和时行疾病,对各种传染病都有较高的易感性。本实验小鼠脾淋巴细胞增殖的CCK-8结果显示,复方颗粒在10～320 μg/mL的浓度下均能够显著促进小鼠脾淋巴细胞增殖,与空白组比较,差异均有统计学意义 (P<0.05),表明复方颗粒能促进免疫细胞增殖,从而提高机体免疫功能。

本研究开发了一种治疗中医瘰疬和调节免疫力的复方颗粒,采用正交实验法以成型率、吸湿率和休止角为考察指标,优化了可溶性淀粉配比、乙醇浓度以及乙醇用量制备工艺,最终确定辅料可溶性淀粉比与提取粉末用量比为1∶1,使用70%的乙醇作为润湿剂,乙醇占冻干粉的重比为50%,加入0.5%阿斯巴甜矫味剂进行制软材, 过2号筛挤压过筛制粒,60 ℃烘干,得到复方幺川调免消瘰颗粒;对成型工艺验证,结果显示优化得到的成型工艺稳定可行;经薄层色谱质量标准初步研究,可以确定复方幺川调免消瘰颗粒中甘草与皂角刺的薄层专属性鉴别条件与方法,建立了斑点分离效果好、斑点清晰且无其他成分干扰,显色效果佳的薄层色谱方法。通过小鼠脾淋巴细胞实验检测复方幺川调免消瘰颗粒对淋巴细胞增殖的影响,结果显示,复方幺川调免消瘰颗粒可以促进LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞的增殖,说明其能够通过影响淋巴细胞调节免疫活性。本实验对该复方制剂的开发、质量标准以及初步的免疫活性进行了初探, 为进一步开发复方幺川调免消瘰颗粒奠定了良好的基础,也为老中医经验方建立完整的质量体系以及药效学研究提供依据。