基于指纹图谱与多指标含量测定的黔产香榧种子质量控制研究

田 鑫,张 艳,余 明,曹泮相,张建永,段灿灿

(1.遵义医科大学 药学院药物分析学教研室,贵州 遵义 563099;2.遵义医科大学 基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室,贵州 遵义 563099;3.贵州务川万年峰农业开发有限公司,贵州 务川 564300)

香榧(TorreyagrandisFort.),为中国原产树种、国家二级保护植物,主产地为江苏南部、浙江等,贵州也有引种。香榧目前的药用部位是种子,其化学成分包括:萜类和挥发油、有机酸、脂肪等。《神农本草经》中有记录榧子“主腹中邪气,去三虫,蛇螫”,并已被2020版《中国药典》收录,其可以起到杀虫消积、润肺止咳和润燥通便的作用[1]。现代的药理学研究表明香榧种子可降血糖[2],且香榧种子中黄酮类化合物的作用较强[3];香榧种子中的烟酸和叶酸具有助消化和滋润皮肤等药理活性[4-5]。然而,目前《中国药典》中仅有榧子(种子)的薄层色谱定性鉴别和酸败度、酸值、羰基值、过氧化值检查项,湖北、山东和上海等省市地方标准中加有杂质、水分、总灰分检查项[6-8]。综上可知,香榧种子目前尚无含量测定项,影响了对香榧种子指标成分的质量控制,制约了其进一步开发利用。

贵州省目前引种香榧树的面积已达到5.1万亩[9],主要分布在遵义市,香榧种子作为主要产品初步形成了产业链,整体发展前景很好。然而引种后的质量和品质如何?目前尚无相关研究。因此,本研究拟建立黔产香榧种子HPLC指纹图谱及多指标含量测定方法,为黔产香榧种子的质量控制和进一步开发提供科学依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 Agilent 1260 Infinity高效液相色谱仪(美国Agilent公司);沃特浦超纯水设备(四川沃特尔水处理设备有限公司);超声波清洗器(宁波新艺超声设备有限公司);电子天平、十万分之一电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)。

1.2 试剂 甲醇(色谱纯,上海阿拉丁生化科技股份有限公司),甲醇(分析纯,成都金山化学试剂有限公司),乙酸(色谱纯,赛默飞世尔科技公司),对照品没食子酸(分析纯,纯度≥99%,批号PS000688,成都普思生物科技股份有限公司),绿原酸(分析纯,纯度≥99%,批号PS08072303,成都普思生物科技股份有限公司)。

1.3 样品 20批香榧种子采自贵州省遵义市务川县石朝乡,经遵义医科大学药学院药物分析教研室张建永教授鉴定为红豆杉科榧树属榧树TorreyagrandisFort.的种子,具体样品信息见表1。

表1 样品产地汇总情况

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备 香榧种子干燥后粉碎,称取香榧种子粉末1.0 g于锥形瓶内,加入20%乙醇30 mL,称重,充分振摇,超声60 min(40 kHz,180 W),待其冷却至室温,再次称重,以20%乙醇补足损失的重量,充分振摇,过0.22 μm微孔滤膜,取续滤液,备用。

2.2 色谱条件 Agilent Eclipse Plus C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);乙腈(A)-0.06%醋酸-水溶液(B)为流动相;梯度洗脱,洗脱程序见表2;在280 nm处检测;流速1.0 mL/min;柱温30 ℃;进样量15 μL。

表2 HPLC梯度洗脱程序

2.3 黔产香榧种子的指纹图谱研究

2.3.1 黔产香榧种子指纹图谱的方法学考察

2.3.1.1 仪器精密度的考察 取香榧种子供试品溶液,按上述色谱条件进样6次,记录5个共有峰的保留时间和峰面积,并分别计算它们的RSD 值,考察色谱峰相似度的一致性。应用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版本),评价其相似度。结果6次测定的5个共有峰保留时间的RSD值不超过1.35%,各色谱峰峰面积的RSD值不超过3.72%,相似度为1.000,仪器精密度良好。

2.3.1.2 重复性试验 取6份同一批次的香榧种子粉末,以相同的方法制得供试品溶液,在同样的色谱条件连续进样,记录5个共有峰的保留时间和峰面积,并分别计算RSD 值,考察色谱峰相似度的一致性。应用中药色谱指纹图谱相似度评价系统,评价其相似度。结果6次测定的5个共有峰的保留时间的RSD值不超过1.35%,各色谱峰峰面积的RSD值不超过2.82%,相似度达到1.000,表明方法重复性良好。

2.3.1.3 稳定性试验 取一份香榧种子粉末按“2.1”项下制备供试品溶液,分别在0、4、8、12、16、20、24 h连续进样7次,记录5个共有峰的保留时间和峰面积,并分别计算RSD 值,考察色谱峰相似度的一致性。应用中药色谱指纹图谱相似度评价系统,评价其相似度。结果5个共有峰保留时间的RSD值不大于2.61%,各色谱峰峰面积的RSD值不超过2.67%,相似度达到1.000,表明样品在24 h内稳定性良好。

2.3.2 黔产香榧种子HPLC指纹图谱的建立 称取不同批次的黔产香榧种子粉末,依照上述方法制备供试品溶液,按色谱条件进样分析。最后有5个特征峰被选出(这5个共有色谱峰峰面积之和大于总峰面积的92.05%,符合建立指纹图谱的技术要求),S1为对照图谱,时间窗宽度是0.1,得到20批黔产香榧种子样品重叠的HPLC指纹图谱,如图1～2。

峰3为没食子酸;峰5为绿原酸。图1 对照指纹图谱

图2 20批黔产香榧种子的HPLC指纹图谱

2.3.3 黔产香榧种子HPLC指纹图谱相似度的评价 应用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版本),用中位数矢量法计算20批黔产香榧种子的指纹图谱与对照指纹图谱的相似度,计算得到20批香榧种子相似度为0.983～1.000,结果见表3,显示相似度良好。

表3 20批黔产香榧种子样品指纹图谱相似度的结果

2.4 香榧种子中2种化学成分的含量测定 与对照品色谱图进行比对后,定性了黔产香榧种子中可能存在没食子酸与绿原酸,本部分对黔产香榧种子中的这2种成分进行定量分析。

2.4.1 溶液配制 单一对照品溶液配制:分别精密称量适量没食子酸和绿原酸于2个25 mL容量瓶内,以20%乙醇定容,充分振摇,得到单一对照品贮备液,其浓度分别是0.380 mg/mL和0.312 mg/mL,过0.22 μm微孔滤膜,备用。

混合对照品溶液①的配制:取2个单一对照品溶液各2.0 mL于试管中,挥干溶剂,加入2.0 mL 20%乙醇定容,充分振摇,即得混合对照品溶液①,过0.22 μm微孔滤膜,备用。

混合对照品溶液②的配制:取2个单一对照品溶液各2.5 mL于5 mL容量瓶中,充分振摇得混合对照品溶液②,过0.22 μm微孔滤膜,备用。

供试品溶液配制:同“2.1”项下方法。

2.4.2 HPLC色谱条件 同“2.2”项。

2.4.3 专属性考察 分别将空白溶剂(20%乙醇)、两种单一对照品溶液、混合对照品溶液②、供试品溶液按色谱条件进样。图3中,黔产香榧种子供试品溶液所测成分没食子酸(280 nm、4.752 min)和绿原酸(280 nm、12.917 min)色谱峰的保留时间与对照品溶液中色谱峰保留时间一致,溶剂与其余成分对测定均无干扰。可见专属性良好。

A:空白溶剂(20%乙醇);B:没食子酸;C:绿原酸;D:混合对照品溶液②;E:供试品溶液;1:没食子酸;2:绿原酸。图3 测试样品的HPLC(280 nm)

2.4.4 线性关系的考察 将混合对照品溶液①按一定比例稀释,按上述色谱条件进样。浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y),绘制标准曲线,计算其回归方程和线性范围等,结果如表4,表明没食子酸和绿原酸的对照品溶液在各自浓度范围里有良好的线性关系,(S/N>10)。

表4 2种对照品的标准曲线

2.4.5 精密度考察 取混合对照品溶液②,在同样的色谱条件下进样6次,分别计算2个对照品色谱峰的保留时间和峰面积的RSD值。没食子酸、绿原酸保留时间的RSD值分别为0.72%和0.56%;峰面积的RSD值分别为0.29%和0.25%,表明仪器精密度良好。

2.4.6 稳定性试验 取同一批次黔产香榧种子,依照上述方法制备供试品溶液,在“2.2”项色谱条件下,在0、4、8、12、16、20、24 h不同时间点进样,分别计算2个对照品色谱峰的保留时间和峰面积的RSD值。没食子酸、绿原酸保留时间的RSD值分别是2.61%和1.25%;峰面积的RSD值分别是4.69%和0.37%。样品在24 h内稳定性良好。

2.4.7 重复性考察 取同一批次黔产香榧种子粉末6份,依照上述方法制得供试品溶液,在同样的色谱条件下进样,分别计算2个对照品色谱峰的保留时间和峰面积的RSD值。结果没食子酸、绿原酸保留时间的RSD值分别是2.56%和1.55%;其含量的RSD值分别是1.49%和0.84%。从结果可以看出该方法的重复性良好。

2.4.8 加样回收率的试验 称取9份已知含量的黔产香榧种子粉末,每份为0.5 g,依次按照80%、100%、120%的比例分别精密加入对应体积的2种单一对照品溶液,按“2.1”项下制备供试品溶液,在“2.2”项色谱条件下进样,记录2种化学成分对应的色谱峰峰面积,计算其加样回收率。没食子酸和绿原酸的平均回收率在97.75%～98.82%,符合95%～105%的范围,RSD≤1.62%,符合要求,由此可见该方法的加样回收率良好(表5)。

表5 黔产香榧种子中2种成分加样回收率的结果

2.4.9 20批香榧种子样品中2种成分的含量测定结果 取20批香榧种子样品,依照上述方法制备供试品溶液,按色谱条件逐个进样,分别将没食子酸和绿原酸的峰面积代入线性回归方程,计算其含量(表6)。其中,没食子酸和绿原酸含量最高的分别是S15(贵州省遵义市务川县石朝乡高峰村)和S8(贵州省遵义市务川县石朝乡浪水村)。该2种化学成分总含量最高的为S9(贵州省遵义市务川县石朝乡浪水村)。

表6 20批香榧种子中2类成分含量(μg/g)

2.4.10 聚类分析 应用Simca-P 14.1软件,共有峰峰面积为变量,展开系统聚类分析(HCA),结果如图4。20批香榧种子样品被分为2类:Ⅰ类包括S14～S16号样品,此类样品均产自遵义市高峰村;Ⅱ类包括S6、S8和S9号样品,此类样品均产自遵义市浪水村;Ⅲ类包括S1～S5、S7、S10～S13和S17～S20号样品,其中S1～S5号样品产自遵义市大漆村,S7号样品产自遵义市浪水村,S10～S13号样品产自遵义市京竹村,S17～S20号样品产自遵义市沙坂村。Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ样品表明不同村子之间的样品存在一定差异。

Ⅰ类:S14～S16号样品;Ⅱ类:S6、S8和S9号样品;Ⅲ类:S1～S5、S7、S10～S13和S17～S20号样品。图4 3类样品聚类分析情况

3 讨论

3.1 方法的建立

3.1.1 色谱柱和流动相考察 考察了2种色谱柱类型:Agilent Eclipse Plus C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)和Agilent Eclipse XDB C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5 μm),结果表明,Agilent Eclipse Plus C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)的柱效更好。并且考察了不同的流动相体系:甲醇-水、乙腈-水、甲醇-醋酸水和乙腈-醋酸水等。结果使用乙腈-0.06%醋酸水为流动相体系时,色谱出峰时间最佳,特征峰分离度可达到要求,色谱图基线较平稳,色谱峰有较好的对称性。

3.1.2 检测波长的选择 采用HPLC-DAD对各对照品以及香榧种子供试品溶液进行全波长扫描。没食子酸和绿原酸的紫外最大吸收波长分别是270 nm和330 nm。但香榧种子在330 nm处无峰,而绿原酸在265 nm左右吸光度最低。在280 nm时,香榧种子中没食子酸和绿原酸对应色谱峰的峰面积都高于270 nm时其二者的峰面积。参考各对照品的紫外光谱图以及香榧种子色谱图,最终决定以280 nm作为没食子酸和绿原酸的检测波长。

3.1.3 黔产香榧种子样品处理方法考察 其他条件相同时,本实验分别考察了5%、10%、20%、40%、70%、100%乙醇提取香榧种子的效果,对比特征峰峰形和峰面积选择最优提取溶剂百分比。再以20%甲醇同法操作,测得结果和20%乙醇的结果相比较。最终确定当提取溶剂为20%乙醇时,样品峰形较好,2个对照品对应色谱峰峰总面积最大。

其他条件相同时,实验中分别考察了超声30、60、90 min提取香榧种子的效果,发现提取60 min时香榧种子的2个对照品对应的峰总面积最大,因此选择提取60 min。

其他条件相同时,实验分别考察了采用超声、冷浸和水浴回流提取香榧种子的效果,发现超声提取香榧种子时,香榧种子的2个对照品对应的峰总面积最大。因此,本研究选择超声方式提取香榧种子。

在保证其余条件一样的情况下,实验考察了料液比1∶10,1∶20,1∶30,1∶40时的香榧种子提取效果,发现料液比1∶30时2个对照品的总含量最高。

香榧种子样品处理方法最终筛选结果为:以20%乙醇提取香榧种子,料液比为1∶30,超声60 min。

3.2 黔产香榧种子质量分析 本实验的20批香榧种子样品采自贵州省遵义市务川县石朝乡的5个不同村子,样品批次多,具有一定的代表性。测定结果表明,20批不同村子香榧种子指纹图谱与对照指纹图谱相似度为0.983～1.000,相似度均较高,表明引种后,贵州省遵义市务川县石朝乡样品之间的指纹图谱具有较好的一致性。20批香榧种子的没食子酸和绿原酸含量分别为 33.25～97.00 μg/g和1 072.28～1 279.56 μg/g。不同村子香榧种子中2种成分含量有一定差异,2种成分总含量平均值为1 231.92 μg/g,总含量最高的为浪水村的S9(1 327.88 μg/g),总含量最低的为沙坂村的S17(1 157.39 μg/g),采自浪水村的S6、S8和S9总含量排进前四位。香榧种子中化学成分总含量的村子排序规律与前期研究中假种皮规律相反,这可能与香榧的生长环境有关。

本实验建立了黔产香榧种子的指纹图谱,建立了同时测定香榧种子中的没食子酸与绿原酸2种化学成分含量的HPLC分析方法,为黔产香榧种子的品质评价及资源利用提供科学依据。更多具有药理活性的化学成分有待进一步研究。