不同产地覆盆子药材的指纹图谱研究

刘桂凤，丁银平，周志强，郑盈莹，任琦

江西省药品检验检测研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西 南昌 330029

覆盆子为蔷薇科植物华东覆盆子Rubus chingiiHu 干燥果实，主要分布在江西、福建、浙江等地，用于阳痿早泄、目暗昏花等病症［1］。覆盆子的质量评价目前主要侧重于鞣花酸、山柰酚-3-O-芸香糖苷等活性成分的含量测定研究［2-6］，难以评价其整体质量。中药指纹图谱可宏观反映中药化学信息，具有整体性强、稳定性好等特点［7-8］，是当今公认的中药质量控制模式，在评价中药真伪优劣和确保药材一致稳定方面具有显著优势。关于覆盆子指纹图谱的研究目前已有少数报道［9-11］，但未见对不同产地药材粉末的研究。由于覆盆子分布区域较广，各产地质量不一，因此采用指纹图谱评价不同产地覆盆子质量很有必要。本研究采用高效液相色谱（HPLC）法，以6 号峰（鞣花酸）为参照，建立不同产地覆盆子的指纹图谱，为其质量控制与资源开发提供一定参考。

1 仪器与试药

UltiMate 3000 型高效液相色谱仪（美国赛默飞世尔科技有限公司）；KQ-500DE 数控型超声波清洗仪（昆山超声仪器公司）；数显恒温水浴锅［国华（常州）电器公司］；梅特勒ML204 型电子天平（梅特勒托利多公司）；Secura 126-1CN 型电子天平（德国赛多利斯公司）。椴树苷对照品（批号112000-201501，含量以100%计），山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品（批号121007-201602，含量以90.8%计），鞣花酸对照品（批号111959-201903，含量以88.3%计），芦丁对照品（批号100080-201811，含量以91.6%计），槲皮素对照品（批号100081-201610，含量以99.1%计），山柰素（山柰酚）对照品（批号110861-201812，含量以93.8%计），以上对照品均购于中国食品药品检定研究院。色谱甲醇和色谱乙腈（sigma 公司）、色谱磷酸（上海麦克林试剂公司）、水为Milli-Q 制备的超纯水。覆盆子药材于2022 年5 月收集于樟树药材市场及药农手中，经江西省药品检验检测研究院中药室主管中药师丁银平鉴定为华东覆盆子Rubus chingiiHu，具体样品信息见表1。

表1 覆盆子样品信息

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1混合对照溶液的制备分别精密称取山柰酚-3-O-芸香糖苷、椴树苷、鞣花酸、芦丁、槲皮素、山柰素对照品适量，加甲醇使溶解制成每1 mL 含山柰酚-3-O-芸香糖苷10 μg、椴树苷10 μg、鞣花酸20 μg、芦丁10 μg、槲皮素10 μg、山柰素10 μg 的混合对照溶液。

2.1.2供试品溶液的制备精密称取覆盆子粉末（过二号筛）约0.5 g，置锥形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2 色谱条件

色谱柱：Agilent 5TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相0.1%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～8 min，85% A；8～23 min，85%→67% A；23～39 min，67%→58% A；39～45 min，58%→72%A）；检测波长为360 nm；流速为1.0 mL/min；柱温为25 ℃；进样体积为10 μL。

2.3 精密度试验

取覆盆子药材（批号：YL220530059）粉末，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.2”项下色谱条件重复进样6 次，以鞣花酸峰为参照，记录色谱图。结果13 个共有峰相对保留时间RSD 均小于0.1%,相对峰面积RSD 均小于2.0%，表明仪器精密度良好。

2.4 稳定性试验

取覆盆子药材（批号：YL220530059）粉末，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，分别于0 h、3 h、7 h、11 h、16 h、24 h，照“2.2”项下色谱条件进样，以鞣花酸峰为参照，记录色谱图。结果13 个共有峰相对保留时间RSD 均小于0.2%，相对峰面积RSD均小于3.0%，表明供试品溶液在24 h 内基本稳定。

2.5 重复性试验

取覆盆子药材（批号：YL220530059）粉末6 份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.2”项下色谱条件进样，以鞣花酸峰为参照，记录色谱图。结果各共有峰相对保留时间RSD 均小于0.1%，相对峰面积RSD均小于3.0%，表明本方法重复性较好。

2.6 指纹图谱的建立与分析

取9 批覆盆子药材照“2.1.2”项下供试品溶液制备方法制样，按“2.2”项下条件进样，得到覆盆子指纹图谱，如图1所示。将覆盆子指纹图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）”，生成对照图谱，如图2。覆盆子指纹图谱共标定13 个共有色谱峰。13 个共有峰的相对保留时间与相对峰面积见表2、表3。

图1 9 批覆盆子叠加指纹图谱

图2 覆盆子对照指纹图谱

表2 覆盆子药材共有峰的相对保留时间 min

表3 覆盆子药材共有峰的相对峰面积

2.6.1峰的确认经与对照品溶液的保留时间和紫外吸收光谱图对比，指认出6 个成分，分别是芦丁（5 号峰）、鞣花酸（6 号峰）、山柰酚-3-O-芸香糖苷（8 号峰）、椴树苷（11 号峰）、槲皮素（12号峰）、山柰素（13 号峰）。混合对照品图谱见图3。

图3 混合对照品图谱

2.6.2不同产地覆盆子相似度结果计算9 批覆盆子样品与对照图谱的相似度，结果见表4。9 批样品相似度计算结果在0.933～0.992，不同产地覆盆子药材化学成分基本一致。

表4 相似度评价结果

2.6.3不同产地覆盆子聚类分析结果采用SPSS13.0统计学软件对9 批覆盆子药材相对峰面积进行聚类分析（between-groups linkage，平方euclidian 距离），结果见图4。根据树状图结果可知9 批样品大体聚为2 类，1、2、3 为一类；4、5、6、7、8、9 为一类。结合样品产地看，前者样品来源于浙江，后者样品采自于江西，与聚类分析结果相一致。表明样品化学成分的相对含量受产地影响。

图4 聚类分析结果

3 讨论

本研究考察了254 nm、316 nm、344 nm、360 nm四个检测波长，经比较发现在360 nm 处样品色谱信息丰富，基线稳定，各色谱峰分离度较好且具有较好的紫外吸收，故检测波长定为360 nm。同时考察了Intersil ODS-SP（4.6 mm× 250 mm，5 μm）色谱柱和依利特C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm）色谱柱，在同一色谱条件下使用三种色谱柱对同一样品进行分析，结果色谱峰峰形良好，表明不同品牌色谱柱对色谱峰影响不大。

覆盆子主要的活性成分为黄酮类化合物。本研究采用甲醇、70%甲醇、乙醇、50%乙醇作提取溶剂。以甲醇和70%甲醇提取的色谱峰峰面积较大，考虑到节能环保，选择70%甲醇作提取溶剂。同时比较超声1 h 和回流1 h，发现加热回流的样品色谱信号峰较多，故本实验采用加热回流1 h 的提取方法。

本研究采用HPLC 法建立了不同产地覆盆子药材的指纹图谱，该方法具有良好的稳定性和重现性；9 批覆盆子指纹图谱相似度均大于0.9，表明不同产地的覆盆子活性成分具有相似性，整体质量一致；但每个共有色谱峰的相对峰面积受产地环境影响而相对含量不同。样品化学成分的相对含量不仅受产地影响，还与样品采集时间、加工方式、储存条件及储存时间有关［12-13］。本研究建立的指纹图谱方法稳定，可为覆盆子药材的资源开发与质量控制提供参考。