三棱标准汤剂指纹图谱及含量测定研究

吴锐华，谭素娴，卢国扬，杜蔼媚

国药集团德众（佛山）药业有限公司，广东 佛山 528000

三棱为黑三棱科植物黑三棱Sparganium stoloniferumBuch.-Ham.的干燥块茎。三棱性平，味辛、苦，归肝、脾经，具消积止痛、行气破血的功效，临床上可用于治疗食积胀痛、癥瘕痞块、瘀血经闭、痛经等病症［1］。

三棱所含有的化学成分比较复杂，主要有黄酮类、挥发油类、生物碱类、有机酸类、苯丙素类，对人体有不同药物功效。除此之外，还含有少量蒽醌、甾体等化学成分［2-8］。三棱在抑制血小板聚集所导致的血栓、对抗炎症、缓解疼痛、抗击肿瘤等方面均可发挥一定药理作用［2-8］。

为促进中药研究标准化，对中药饮片标准汤剂的研究显得至关重要，其不仅有助于制剂工艺进步，而且还可以提升药物质量，为中药配方颗粒制备、研发和质量控制提供相关的理论依据［9］。

本研究是在前人对三棱药材研究的基础上，鉴于三棱标准汤剂为水煎煮而得，脂溶性成分较难转移，建立一套基于超高效液相色谱（UPLC）指纹图谱和指标成分含量测定的三棱标准汤剂质量评价方法［10-12］。

1 实验材料

电子天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司，SQP 型，精度分别为0.1 mg 和0.01 mg］；超声仪（东莞市大朗速洁超声设备制造厂，DC400）；电热恒温水浴锅（天津泰斯特仪器有限公司，DK-98-Ⅱ）；台式离心机（上海安亭科学仪器厂，KA-1000）；旋转蒸发仪（巩义予华仪器有限公司，YRE-301）；超高速液相色谱仪（赛默飞世尔科技公司，UPLC Vanquish）。

甲醇（分析纯，江苏强盛功能化学股份有限公司）；乙醇（分析纯，广东光华科技股份有限公司）；乙腈（色谱纯，德国Merck 公司）；冰醋酸（色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司）；香草酸（批号：110776-201503，含量99.8%，中国食品药品检定研究院）；阿魏酸（批号：110773-201614，含量99.6%，中国食品药品检定研究院）；对香豆酸（批号18011605，含量99.97%，成都普菲德生物科技有限公司）；香草醛（批号20120820，国药集团化学试剂有限公司）。

15 批三棱饮片，购自浙江、江西、安徽和湖南等地，根据《中国药典》2020 版三棱标准进行检验，全部符合药典标准。见表1。

表1 15批三棱饮片的产地信息表

2 方法与结果

2.1 三棱饮片标准汤剂的制备

依照2016 年国家药典委员会发布的《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求（征求意见稿）》制备标准汤剂。取150 g 三棱饮片，置电加热陶瓷壶中，加适量水分两次煎煮，首次煎煮加入药材重量9 倍量的水，浸泡30 min 后，先用武火（500 W）将药液煮沸，再用文火（200 W）使其微沸，时间为30 min，之后使用200 目筛网过滤煎液，滤液置于密闭容器中保存并用冷水冷却。第二次煎煮加入药材重量7 倍量的水，先用武火（500 W）将药液煮沸，再用文火（200 W）使之维持微沸25 min，用200 目筛网，趁热过滤煎液，滤液转移至密闭容器中并用冷水冷却。合并两次煎液并将其转移至圆底烧瓶中，在低温条件下采用旋转蒸发仪进行减压浓缩（真空度为-0.08 MPa～-0.1 MPa；温度为60 ℃），转速50～90 r/min，浓缩至约150 mL。浓缩液在磁力搅拌下，吸取2 mL 均匀分装于10 mL棕色西林瓶中，置冷冻真空干燥机中进行干燥，取出，轧上铝盖，即得。

2.2 指纹图谱的研究

2.2.1色谱条件色谱柱：Waters CORTECS T3（100 mm×2.1 mm，1.6 µm）；流动相：乙腈（A）-0.1%冰醋酸溶液（B），梯度洗脱（0～2 min，93% B；2～10 min，93% →87% B；10～17 min，87% →67% B；17～25 min，67%→60% B）；检测波长：300 nm；流速：0.3 mL/min；进样量：1 μL；柱温：35 ℃，每次运行完后预平衡5 min。

2.2.2对照品溶液的制备分别精密称取香草酸、香草醛、对香豆酸和阿魏酸对照品适量，加乙醇制成每1 mL 含10 μg 的溶液，作为对照品溶液。

2.2.3供试品溶液的制备取三棱标准汤剂冻干粉，研至细粉状，取约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇15 mL，称定重量，超声处理30 min（功率400 W，频率40 kHz），放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4精密度试验将同一供试品溶液连续进行6 次，所得数据显示标准汤剂各色谱峰以对香豆酸为参照的相对保留时间RSD 值均在0.2%以内，相对峰面积的RSD 值均在3.0%以下，表明仪器精密度良好。

2.2.5重复性试验按“2.2.3”项下的操作方法，同时制备六份供试品溶液并进行检测和计算，数据显示各色谱峰以对香豆酸为参照的相对保留时间RSD值均不超过0.2%，相对峰面积的RSD 值均在3.0%以下，表明此方法的重复性良好。

2.2.6稳定性试验取同一份三棱标准汤剂供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、16、24 h 进样，对其进行检测分析，计算结果显示以对香豆酸为参照的相对保留时间RSD 值在0.2%以内，相对峰面积的RSD 值则均在2.0%以下，表明供试品在24 h内稳定。

2.2.7指纹图谱的建立依照“2.2.3”项下方法，制备15 批三棱标准汤剂供试品溶液并使用UPLC 色谱仪测定其液相图谱，利用《中药指纹图谱相似度评价系统（2012 版）》软件，导入色谱数据，并通过比较图谱相似度来分析实验结果。见图1。

图1 15批三棱标准汤剂特征图谱共有峰

2.2.8共有峰的确认使用中位数计算方法，对图谱进行多点校正，自动匹配色谱峰，生成对照指纹图谱，其中共有峰有8 个。峰1 为香草酸，峰2 为香草醛，峰3 为对香豆酸；峰5 为阿魏酸。参照峰设定为对香豆酸，算出8 个共有峰的相对保留时间，结果分别为0.57、0.86、1.00、1.16、1.25、2.29、2.61、2.75。见图2。

图2 三棱标准汤剂对照特征图

2.2.9相似度评价经过相似度评价系统评测后，算出相似度，结果显示均高于0.98，见表2，说明15批三棱标准汤剂样品比较一致。

表2 15批三棱标准汤剂指纹图谱相似度

2.3 含量测定方法的建立

2.3.1色谱条件同“2.2.1”项下。

2.3.2对照品溶液的制备精密称取对香豆酸对照品17.49 mg 置100 mL 棕色量瓶中，加乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密移取10 mL 置100 mL棕色量瓶中，加乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为17.48 μg/mL 的溶液，即得。

2.3.3供试品溶液的制备同“2.2.3”项下。

2.3.4专属性试验取空白溶液、对香豆酸对照品溶液、三棱标准汤剂供试品溶液，分别进样检测，结果显示空白溶液对检测无干扰，色谱峰分离度大于1.5，且供试品与对照品色谱峰保留时间一致，说明专属性良好。见图3。

图3 专属性试验色谱图：A.空白溶液；B.对香豆酸对照品溶液；C.三棱标准汤剂供试品溶液

2.3.5精密度试验连续进样同一个对照品溶液6次，结果RSD 值小于0.8%，表明仪器具备良好的精密度。

2.3.6重复性试验按“2.2.3”项下的操作方法，同时制备六份供试品溶液，进样测定并计算对香豆酸含量及RSD 值。结果显示其含量均值为0.021 7%，RSD 值为0.7%，表明实验具有较好的重复性。

2.3.7稳定性试验取同一份三棱标准汤剂供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、16、24 h 进样，检测结果显示对香豆酸峰面积RSD 值为0.7%，表明三棱标准汤剂供试品在24 h 内基本稳定。

2.3.8线性试验取17.48 μg/mL 对香豆酸对照品溶液,分别稀释成浓度为0.874、1.748、3.496、4.370、6.992、8.740 μg/mL 的对照品溶液，照“2.2.1”项下色谱条件检测其在不同浓度下的峰面积，然后将对香豆酸浓度（X）设置为横坐标，其色谱峰面积（Y）设置为纵坐标，通过线性回归分析得到其回归方程为Y=0.432 6X-0.044 7（r=0.999 9），表明在0.874～17.480 µg/mL 范围里，对香豆酸浓度与峰面积线性关系良好。

2.3.9加样回收试验取已知含量三棱标准汤剂样品6 份，按100%加入量分别加入适量的对香豆酸对照品，按“2.2.3”项下操作方法制备，计算回收率，结果显示标准汤剂中对香豆酸平均回收率为94.47%，RSD 值为1.0%，说明该方法准确性良好。见表3。

表3 加样回收试验结果

2.3.10不同批次标准汤剂含量测定结果依照“2.2.3”项的操作步骤，对15 批三棱标准汤剂供试品溶液进行制备，检测其对香豆酸含量，所得数据结果见表4。

表4 15批三棱标准汤剂对香豆酸含量 %

3 讨论

分别在254、300、360 nm 下对三棱标准汤剂进行检测。在254 nm 时图谱中脂溶性成分色谱峰响应值低，色谱峰数量较少；在360 nm 时图谱中水溶性成分色谱峰响应值低，色谱峰数量较少；将波长设置为300 nm 时，相应的水溶性色谱峰以及脂溶性色谱峰都出现了比较高的响应值，各峰分离状态情况好，基线比较稳定，所以将波长参数设置为300 nm。因为柱温会影响色谱峰的保留时间，故分别对比各色谱峰在柱温为30、35、40 ℃时的分离度，发现当柱温为35 ℃时，各峰分离效果较好。

对三棱标准汤剂的提取方式、提取溶剂及提取时间进行考察，通过比较峰面积大小来确定三棱标准汤剂特征图谱的样品前处理方法。提取所使用的方式主要对比了超声以及回流提取，提取溶剂对比70%甲醇、70%乙醇以及水三种溶剂，提取时间比较了15、30、45 min。结果发现，在相同时间下超声和回流对于指纹图谱和对香豆酸含量结果影响不大。提取溶剂对比试验中，70%甲醇、70%乙醇提取的情况比较好，考虑到乙醇毒性较低，所以本研究使用了70%乙醇。超声时间对比试验结果说明超声提取30 min，各成分的提取程度已经达到了峰值。

UPLC 指纹图谱有助于对配方颗粒、标准汤剂等中药制剂进行质量控制。通过计算，对照指纹图谱和15 批三棱标准汤剂的UPLC 指纹图谱相似度范围在0.985～0.998 之间，可见不同产地来源和批次的三棱饮片制备所得的三棱标准汤剂具有良好的一致性，但对香豆酸含量RSD 值为25.3%，差异较大，说明三棱标准汤剂的含量受三棱饮片产地来源影响较明显。