夏枯草提取物含药血清的体外抗炎活性研究

郑洋滨，刘宁，周年，熊明朋，洪燕

江西省药品检验检测研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西 南昌 330029

夏枯草为唇形科夏枯草属植物，味辛、苦，寒，归肝、胆经，具有清火泻火、明目、散结消肿之功效；主要具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、降血压等药理作用［1］。夏枯草口服液和夏枯草膏已广泛应用于临床，主要有清火，散结，消肿的作用。已有文献报道夏枯草提取物在体外有一定的抗炎作用［2-5］，但由于中药提取物成分复杂，在体内经过一系列代谢后难以保证达到和体外一样的药效。将中药提取物对动物进行灌胃后，取动物的含药血清用于体外实验，就比较接近于药物在人体内环境产生的药理作用［6］。因此，本研究通过细菌脂多糖（LPS）刺激小鼠巨噬细胞RAW 264.7 造成炎症模型，观察夏枯草提取物含药血清对炎性因子一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素1β（IL-1β）的调节作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性SD大鼠40只，180～220g，购自长沙市天勤生物技术有限公司，动物合格证号：NO.430726211100071368，实验动物生产许可证号：SCXK（湘）2019-0014。饲养于江西省药品检验检测研究院屏障级环境中，实验动物使用许可证号：SYXK（赣）2019-0001。

1.2 细胞株

小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（RAW 264.7）购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.3 实验样品及试剂

夏枯草药材购自黄庆仁栈华氏大药房，经国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室万林春主任中药师鉴定为正品。RAW 264.7 专用完全培养基、无血清的DMEM 培养基、脂多糖（LPS）（批号分别为WH1622C291、WH0021D161、No.0109A031，均购自上海语纯生物科技有限公司）。一氧化氮含量检测试剂盒［批号：No.20220406，金克隆（北京）生物技术有限公司，批号：No.20220406］。小鼠IL-1β ELISA 试剂盒、小鼠TNF-α ELISA 试剂盒、小鼠IL-6 ELISA 试剂盒（批号均为04/2022，均购自上海语纯生物科技有限公司）。

1.4 实验仪器

CO2恒温培养箱（赛默飞世尔科技公司，型号：311）；酶标仪（赛默飞世尔科技有限公司，型号MULTISKAN GO）；细胞计数器（上海睿钰生物科技有限公司，型号：IC1000）。

2 实验方法

2.1 含药血清的制备

SD 大鼠40 只，适应性喂养5 d 后，随机分为空白对照组和夏枯草氯仿提取物组，夏枯草乙酸乙酯提取物组，夏枯草正丁醇提取物组，每组10 只。灌胃给予相应的药物溶液（按照得率计算12.5 mg/kg），10 mL/kg，每天2 次，连续3 d，空白对照组给予等体积的纯化水。末次给药后1 h，麻醉大鼠，经腹主动脉取血，4 ℃静置30 min 后，3 000 r/min 离心15 min 分离含药血清。将同组大鼠血清混匀，56 ℃水浴加热30 min 灭活血清，0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌，冻存管分装，-20 ℃保存备用。

2.2 含药血清对细胞增殖度的影响试验

取生长状态良好的RAW 264.7 细胞，取用无菌细胞刮刮下细胞，再用枪吹打成单细胞悬液。将细胞悬液离心（1 000 r/min，5 min），弃去上清，用无血清的DMEM 培养基调细胞数为1×105个/mL，100 μL/孔接种于96孔板。待细胞贴壁后吸去培养基，按空白对照（10%胎牛血清），阴性对照（20%空白对照组大鼠血清），5%、10%、20%各提取物组含药血清孵育，每组设6 个复孔，每孔加100 μL。孵育24 h 后，吸弃上清，每孔加100 μL 不含血清的DMEM 培养基和20 μL 浓度为5 mg/mL 的MTT，继续培养4 h，吸弃上清，每孔加入150 μL 的DMSO，490 nm 处测定吸光度。细胞增殖率=各给药组吸光度/空白对照组吸光度×100%。

2.3 含药血清对巨噬细胞RAW264.7 的炎性因子的影响试验

取生长状态良好的RAW 264.7 细胞，用细胞刮刮下细胞，吹打制成单细胞悬液。将细胞悬液离心（1 000 r/min，5 min），弃去上清，用无血清的DMEM 培养基调细胞数为1×105个/mL，接种于24 孔板中，每孔1.5 mL，24 h 细胞贴壁后，加入相应血清。

LPS 用无血清 DMEM 培养基溶解，稀释至浓度100 μg/mL 作为母液。将贴壁后细胞分为阴性对照组，模型对照组，各提取物高、中、低剂量组（分别为20%含药血清、10%含药血清、5%含药血清）。阴性对照组加入空白对照组大鼠血清400 μL 和无血清DMEM 培养基100 μL；模型对照组加入空白对照组大鼠血清400 μL、无血清DMEM 培养基80 μL 和LPS 母液20 μL；20%含药血清组加入含药血清400 μL、无血清DMEM 培养基80 μL 和LPS 母液20 μL；10%含药血清组加入含药血清200 μL、空白对照组大鼠血清200 μL、无血清DMEM 培养基80 μL 和LPS 母液20 μL；5%含药血清组加入含药血清100 μL、空白对照组大鼠血清300 μL、无血清DMEM 培养基80 μL 和LPS 母液20 μL。

每一剂量组设3 个复孔，LPS 终浓度为1 μg/mL。继续孵育24 h 后，收集上清液，采用ELISA 法按照试剂盒说明书测定的含量。

3 统计学方法

4 结果

4.1 含药血清对细胞增殖度的影响

试验结果表明，夏枯草各提取物含药血清对RAW 264.7 的增殖无影响。见图1。

图1 含夏枯草各提取物血清对细胞增殖度的影响

4.2 含药血清对巨噬细胞RAW264.7 的炎性因子的影响

试验结果表明，模型对照组各炎性因子含量均显著高于阴性对照组，差异有统计学意义。高、中、低剂量的夏枯草氯仿提取物含药血清均能降低IL-6和NO 含量，与模型对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；此外，高、中剂量的夏枯草氯仿提取物含药血清还能降低IL-1β 和TNF-α 含量，与模型对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1 含药血清对巨噬细胞RAW264.7的炎性因子的影响（，n=3）

注：与阴性对照组比较，aP<0.01；与模型对照组比较，bP<0.01，cP<0.05。IL-1β：白细胞介素1β；IL-6：白细胞介素6；NO：一氧化氮；TNF-α：肿瘤坏死因子。

5 结论

内毒素诱导的RAW264.7 细胞模型，被广泛用于体外的抗炎实验中。RAW264.7 细胞在LPS 刺激下，可使细胞炎症介质和促炎细胞因子的分泌增加，如：TNF-α、IL-6 和IL-1β、NO。IL-1β 是最重要的炎性细胞因子之一，它介导了炎症的重要过程，大量产生时引起发热和恶病质［6］。TNF-α 是炎症反应的始动因子，可使黏附的中性粒细胞产生呼吸爆发，并促进其他多种促炎细胞因子的表达［7-9］。IL-6 多功能炎性细胞因子，具有致炎和抗炎的双向功能，当产生过多会引起一系列的炎性损害，体内IL-6 水平上升，可以导致多种疾病［10-11］。NO 在炎症反应中的作用机制复杂，不同酶产生的NO 作用不一，在病理状态中，诱导型一氧化氮合酶（iNOS）广泛表达，NO 水平升高造成局部组织损伤［12-13］。

本次试验中，经20%、10%和5%氯仿提取物含药血清孵育后，可显著降低LPS 诱导的RAW264.7细胞分泌的IL-6 和NO 水平（P<0.05）。经20%和10%氯仿提取物含药血清孵育后，可显著降低LPS诱导的RAW264.7 细胞分泌的IL-1β 和TNF-α 水平（P<0.05）。正丁醇和乙酸乙酯提取物含药血清对炎性因子均无显著影响，说明无抗炎作用。

综上所述，夏枯草氯仿提取物含药血清能显著降低炎症模型中的炎性因子含量。但是其具体的作用机制，还有待进一步试验。