减肥胶囊显微鉴别及含量测定方法研究

贾力，王蕾，支荣荣

盐城市食品药品监督检验中心，江苏 盐城 224055

减肥胶囊现行质量标准为国家药品监督管理局标准WS-11266（ZD-1266）-2002，由番泻叶、虎杖、海藻酸钠、人参茎叶皂苷粉组成。该制剂具有清热、活血、降浊的功效，用于痰瘀互结之高脂血症［1］。处方中番泻叶具有泻热行滞，通便，利水的功效。番泻叶中含有二蒽酮类衍生物，具有泻下的作用，其中泻下作用最为显著的是番泻苷A 和番泻苷B［2-3］。虎杖具有利湿退黄，清热解毒，散瘀止血的功效。现代药理研究表明，虎杖及其活性成分虎杖苷具有降血脂、改善微循环、抗氧化等作用［4-5］。

现行标准由于批准日期较早，限于当时的技术研究条件，检验项目仅有理化鉴别、HPLC 测定大黄素含量。而大黄素具有抗炎的作用，并没有泻下清热及降血脂的功效，显然作为质控指标是不合理的。因此，本研究以番泻叶中番泻苷A 和番泻苷B，虎杖中虎杖苷三个有效成分为对象，建立HPLC 法同时测定三种成分的含量，以期更为简便、全面地控制该制剂质量。另外，番泻叶、虎杖在处方中均以中药原粉入药，未经提取工艺，本研究建立了该两种中药粉末的显微鉴别方法。

处方中海藻酸钠是藻类植物的提取物，但其含量测定方法目前尚无报道；人参茎叶皂苷具有活血化瘀功效，对高血脂具有辅助治疗的功效，质量标准中已建立TLC 鉴别方法，故本研究未对海藻酸钠及人参茎叶皂苷含量测定作进一步研究。

1 仪器与材料

1.1 仪器

LEICA DM 3000 显微镜（德国莱卡显微系统有限公司）；Ultimate U3000 型高效液相色谱仪（赛默飞世尔科技有限公司）；BP211D 电子天平（梅特勒托利多科技有限公司）；Milli-Q 超纯水系统（德国默克科技有限公司）。

1.2 试剂试药

番泻苷A 对照品（批号：110824-202003，含量：97.2%），番泻苷B 对照品（批号：110825-202004，含量：96.0%），虎杖苷对照品（批号：111575-201603，含量：87.3%）均购自中国食品药品检定研究院；醋酸、磷酸氢二钠、醋酸钠、碳酸氢钠、四庚基溴化铵、乙腈、乙醇等均为色谱纯，水合氯醛、丙三醇为分析纯；减肥胶囊（吉林省银诺克药业有限公司,国药准字Z20026991，批号：20210801、20210703、20200506，规格：0.3 g/粒）。

2 实验方法与结果

2.1 显微鉴别［6-7］

番泻叶粉末显微特征：晶纤维多。非腺毛单细胞，长100～350 μm，直径12～25 μm，壁厚，有疣状突起。草酸钙簇晶存在于叶肉薄壁细胞中，直径9～20 μm。上下表皮细胞表面观呈多角形，垂周壁平直；上下表皮均有气孔，主为平轴式，副卫细胞大多为2～3 个。见图1。

图1 番泻叶粉末显微图（×400倍）

虎杖粉末显微特征：草酸钙簇晶极多，较大，直径30～100 μm。石细胞淡黄色，类方形或类圆形，有的呈分枝状，分枝状石细胞常2～3 个相连，直径24～74 μm，有纹孔，胞腔内充满淀粉粒。木栓细胞多角形或不规则形，胞腔充满红棕色物。具缘纹孔导管直径56～150 μm。见图2。

图2 虎杖粉末显微图（×400倍）

2.2 番泻叶、虎杖主成分的含量测定

2.2.1色谱条件［8］色谱柱：SVEA opal C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-［醋酸-醋酸钠缓冲液（pH5.0）（1 →10）混合溶液1 000 mL 中，加入四庚基溴化铵2.45 g］（23∶77）；检测波长：260 nm（番泻苷A、番泻苷B），306 nm（虎杖苷）；柱温：30 ℃；流速为1.0 mL/min；进样量为10 μL。

2.2.2对照品溶液的制备分别取番泻苷A 对照品10.52 mg、番泻苷B 对照品15.79 mg、虎杖苷对照品11.58 mg，分别置25 mL、50 mL、100 mL 棕色量瓶中，分别加0.1%碳酸氢钠稀乙醇溶液制成每1 mL 含番泻苷A 0.409 0 mg、番泻苷B 0.303 2 mg、虎杖苷0.101 1 mg 的对照品储备溶液（供加样回收率试验用）。分别精密吸取三种储备液1 mL，置10 mL 量瓶中，加0.1%碳酸氢钠稀乙醇溶液至刻度，制成每1 mL 含番泻苷A 40.90 μg、番泻苷B 30.32 μg、虎杖苷10.11 μg 的对照品混合溶液（供含量测定及线性关系考察用）。

2.2.3供试品溶液的制备取样品细粉约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入0.1%碳酸氢钠稀乙醇溶液25 mL，称定重量，超声处理15 min（30～40 ℃），放冷，再称定重量，用0.1%碳酸氢钠稀乙醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4阴性对照溶液按照质量标准制备工艺制备取缺番泻叶及缺虎杖的阴性样品，各取0.5 g，同供试品溶液的制备方法制备。

2.2.5专属性试验精密量取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL，按“2.2.1”项下方法测定。结果供试品色谱在与混合对照品色谱相应的位置上有相同色谱峰，番泻叶阴性样品在番泻苷A 和番泻苷B 的位置上无色谱峰，虎杖阴性样品在虎杖苷的位置上无色谱峰。表明供试品中其他成分对目标成分无干扰，本方法有良好的专属性。见图3。

图3 专属性试验色谱图:A.番泻苷A、番泻苷B、虎杖苷混合对照品溶液；B.供试品溶液；C.缺番泻叶阴性对照溶液；D.缺虎杖阴性对照溶液

2.2.6线性关系考察精密量取“2.2.2”项下对照品溶液1、2、4、10、16、20、30 μL 进行测定，以峰面积Y为纵坐标，对照品的质量X（μg）为横坐标，绘制标准曲线，计算得回归方程，结果表明，各成分在各自范围内与峰面积呈良好的线性关系。见表1。

表1 线性关系表

2.2.7精密度试验精密吸取“2.2.2”项下对照品溶液，连续进样6 次，番泻苷A、番泻苷B、虎杖苷峰面积的RSD 分别为0.20%、0.52%、0.78%（n=6），精密度良好。

2.2.8稳定性考察吸取同一份供试品溶液，于0，6，12，24，48 h 分别进样10 μL，按“2.2.1”项下条件测定，番泻苷A、番泻苷B、虎杖苷峰面积的RSD 分别为0.30%、0.63%、0.55%（n=5），供试品溶液在48 h 内稳定。

2.2.9重复性试验精密称取同一批样品（批号为20210801），按“2.2.3”项下供试品溶液制备方法平行制备6 份，依次测定，番泻苷A、番泻苷B、虎杖苷的平均含量分别为1.486 2 mg/g、1.066 5 mg/g、0.433 3 mg/g，RSD 分别为0.41%、0.55%、0.98%，重复性良好。

2.2.10加样回收率试验精密称取已知含量的样品0.25 g，六份，分别精密吸取“2.2.2”项下的番泻苷A、番泻苷B、虎杖苷对照品储备溶液各0.9 mL（0.368 1 mg）、0.9 mL（0.272 9 mg）、1.0 mL（0.101 1 mg），依法制得供试品溶液（对照品体积代入公式计算含量）。分别吸取上述溶液各10 μL 测定回收率。见表2～4。

表2 番泻苷A加样回收率试验结果（n=6）

表3 番泻苷B加样回收率试验结果（n=6）

表4 虎杖苷加样回收率试验结果（n=6）

2.2.11样品含量测定照“2.2.1”项下方法测定3批样品，结果见表5。

表5 样品含量测定结果 mg/g

3 讨论

3.1 显微特征的选择

处方中，海藻酸钠和人参茎叶皂苷粉均为提取物，不具备生药组织细胞特征，番泻叶和虎杖均为原粉入药，番泻叶具有晶纤维、非腺毛、草酸钙簇晶、表皮细胞（气孔）等特征，虎杖具有草酸钙簇晶、石细胞、木栓细胞、具缘纹孔导管等特征。两味药组织特征差异较大，具有较强的专属性，虽然两者均有草酸钙簇晶，但是番泻叶簇晶细小，而虎杖簇晶粗大，很易区分，因此，直观、简便、环保的显微鉴别可以代替薄层色谱等其他鉴别方法。

3.2 色谱条件的选择

选择比较了《中国药典》2020 年版一部番泻叶和虎杖含量测定项中的流动相［8］，番泻苷A、番泻苷B 在虎杖含量测定流动相系统中，不能出峰，而虎杖苷在番泻叶含量测定所用流动相中能有效分离，且准确度、精密度均符合药典要求，故选择番泻叶含量测定的流动相系统。同时比较了乙腈-0.1%三氟乙酸、乙腈-0.1%磷酸流动相，供试品分离度均较差［9-10］。

3.3 供试品提取方法的选择

番泻苷在0.1%碳酸氢钠溶液中溶解性较好，虎杖苷在稀乙醇中溶解度较好［8］，兼顾两种成分的溶解性，本研究采用0.1%碳酸氢钠稀乙醇溶液同时提取两种成分，经与《中国药典》规定的两种药材提取溶剂比较，提取效率相当。本研究还考察了溶剂体积、回流、超声、提取时间等因素，最终确定了“2.2.3”项下供试品制备方法。考虑到虎杖苷对光的不稳定性，实验需要避光。