基于ITS2 序列对市售白扁豆的鉴别研究

毕武，聂平，孙辉，丁野，张文娟，马双成

1.湖南省药品检验检测研究院，湖南省药品质量评价工程技术研究中心，湖南 长沙 410001；2.湖南省药品审核查验中心，湖南 长沙 410013；3.中国食品药品检定研究院，北京 100050

白扁豆为我国常用中药材，来源于豆科扁豆属植物扁豆Dolichos lablabL.（Lablab purpureus）的种子，具有消暑除湿，健脾止泻的功效［1］，同时也广泛作食用，是一种药食两用品种。目前有参苓白术散、健脾糕片、婴儿健脾颗粒等近20 个中成药中含有白扁豆。研究［2-3］表明，白扁豆具有降糖、抗炎镇痛、抗结石等多种活性，主要含有三萜皂苷（如Lablabosides A,B and C）、凝集素等化学成分，还含有丰富的谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、亮氨酸等氨基酸，饱和脂肪酸（24.2%），单不饱和脂肪酸（18.42%）和多不饱和脂肪酸（57.38%）等脂肪酸类成分，其中以亚油酸含量较高。此外，还有高含量的钾，少量的钙、铁、锌等微量元素。

白扁豆在世界各热带地区均有栽培。我国南北朝时名医陶弘景所撰《名医别录》中记载扁豆已有栽培［4］。白扁豆目前在全国均有种植，尤其以云南、四川种植面积较大。市场供应分为国内、国外两种货源。因此，一方面白扁豆存在国外非药用品种混用或误用的可能；另一方面，由于中药的有效性往往与生长环境等密切相关，国外以及国内不同地域栽培的白扁豆品种之间是否存在差异也未见相关报道。

DNA 条形码概念是加拿大学者Paul Hebert 于2003 年首次提出［5］，之后引起各国学者们的广泛关注，该技术利用基因组中一段公认标准的、相对较短的DNA 片段来进行物种鉴定，具有不受生物个体形态特征、发育阶段和外界环境等因素影响的优势，近年来在动植物分类鉴定尤其是在药用植物鉴定研究方面得到广泛应用，取得了很大进展［6-7］。核糖体内部转录间隔区2（internal transcribed spacer 2，ITS2）序列由于具有序列短，易扩增，鉴定能力强等优点,成为目前药用植物DNA 条形码鉴定的常用序列之一。因此，本研究通过ITS2 条形码序列对不同来源市售白扁豆进行鉴别分析，了解市售白扁豆的具体状况。

1 材料

1.1 实验材料

31 批白扁豆样品通过市场、网络购买等方式收集。样品信息详见表1。

从GenBank 数据库中下载已公布的57 份白扁豆和14 份混伪品的ITS2 序列信息，详见表2。

表2 从GenBank数据库下载的白扁豆及其混伪品ITS2序列信息

1.2 仪器设备

混合球磨仪（型号MM400，德国Resch 公司）；微量冷冻离心机（型号Fresco21，美国Thermo Fisher Scientific 公司）；电子天平（型号JA5003，上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；PCR 扩增仪（型号Labcycler，SensQuest 公司）；全自动凝胶成像系统（型号G：BOX XT4，英国Syngene 公司）；电泳仪（型号BG-Power600，北京百晶生物技术有限公司）；数显恒温水浴锅（型号BH8104-D，杭州保恒恒温技术有限公司）。

1.3 试药

离心柱型植物基因组DNA 提取试剂盒、2×Taq Master Mix 缓冲液均购自天根生化科技（北京）有限公司；100bp DNA ladder marker（上海捷瑞生物工程有限公司）；GeneRed Nucleic Acid Dye（19G0326，Biotium）；ITS2 扩增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2 实验方法

2.1 DNA 的提取

取适量白扁豆样品，用75%的酒精擦拭表面进行消毒处理，待自然挥干后经球磨仪研磨，取30 mg左右研磨后的细粉，加入700 μL 基因组DNA 提取试剂盒中的DNA 裂解液，56 ℃水浴2 h，期间混匀3～4次，采用植物基因组DNA 提取试剂盒提取总DNA，具体提取步骤按说明书进行。

2.2 PCR 扩增和测序

PCR反应体系为25μL，包括2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，ITS2 引物（ITS2F ：5'-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3' ；ITS3R ：5'-GACGCTCTCCAGACTACAAT-3'）［8］各1 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。ITS2 序列PCR 扩增程序为94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，56 ℃，30 s，72 ℃，45 s，35 个循环；72 ℃，10 min。采用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 扩增产物，将具有单一明亮目的条带的产物送往湖南大地同年生物科技有限公司进行双向测序。

2.3 数据处理与分析

将测序获得的序列数据使用 CodonCode Aligner 10.0 软件对测序峰图校对，去除引物及低质量区后进行拼接。通过ITS2 注释网站（http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de）进行注释，获得不含5.8S和28S 两端区段后的ITS2 间隔区序列。对所得序列通过美国国家生物技术信息中心（NCBI）的BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）进行相似性搜索，进行物种鉴别。利用MEGA 11.0 软件对序列进行多重比对分析，计算不同碱基的比例，查找变异位点，并构建邻接（neighbor-joining，NJ）系统发育树。

3 实验结果

3.1 白扁豆样品性状

从收集的白扁豆样品性状来看，不同样品的形状，大小以及外表面等存在较大差异，部分样品表面存在黑色斑点，典型样品见图1。

图1 白扁豆典型样品性状图

3.2 PCR 扩增及测序结果

利用通用引物对31 份市售白扁豆样品ITS2 序列扩增，均获得成功，成功率为100%。测序结果显示，ITS2 序列的PCR 扩增产物双向测序均获成功，获得序列质量高。因此，后续对ITS2 序列展开深入分析。

3.3 基于ITS2 序列的物种鉴定

将拼接好的ITS2 序列通过数据库注释获得ITS2 条形码序列。注释得到的31 条ITS2 条形码序列在GenBank 数据库中通过Blast 进行相似性搜索，完成物种鉴定。鉴定结果显示，样品序列与数据库中最匹配的物种为Lablab purpureus，相似度均在99%以上。由此可以说明，ITS2 序列能够准确鉴定市售白扁豆药材。本次实验样品均为正品白扁豆，可用于下一步的分析。

3.4 ITS2 序列特征分析

实验共得到经注释后的ITS2 序列88 条，其中白扁豆样品序列31 条，从GenBank 数据库下载的序列57 条。应用MEGA 11.0 软件将这些序列进行比对分析，结果显示，白扁豆ITS2 序列长度为216～218 bp，C+G 占比为46.8%～47.3%。种内变异较少，经与峰图确认（因部分GenBank 数据库下载序列在这两个位点未明确具体碱基），共存在2 个变异位点，分别为86 位点D 的A →G 和174 位点的G →C（代表性峰图如图2 所示）。根据对变异位点的分析，可将白扁豆归纳为6 种主要的单倍型（B1～B6），具体如表3 所示。

图2 白扁豆ITS2序列杂合型变异位点峰图

表3 白扁豆ITS2序列变异位点

3.5 白扁豆与其混伪品遗传发育分析

基于ITS2 条形码序列，通过邻接法构建白扁豆与其常见的7 种混伪品14 条序列的NJ 树（见图3）。由图中可见，白扁豆与其混伪品硬皮豆、眉豆等能明显区分。不同单倍型白扁豆聚为一支，眉豆和豇豆聚为一支（因眉豆为豇豆的亚种），镰扁豆、硬皮豆、金甲豆、菜豆和荷包豆这些不同的种各自聚在一起。从亲缘关系来看，白扁豆与眉豆、豇豆的亲缘关系最近；与镰扁豆、硬皮豆的亲缘关系次之；与金甲豆、菜豆和荷包豆的亲缘关系相对较远。因此，通过ITS2 条形码能很好地区分白扁豆药材及其常见的混伪品或近缘种。

图3 基于ITS2的系统发育分析（NJ树）

3.6 白扁豆与其混伪品二级结构比较分析

通过ITS2 注释网站对白扁豆及其常见混伪品的ITS2 序列二级结构进行了预测，结果见图4。总体上来看，白扁豆及其常见混伪品均由一个中心环和四个螺旋结构组成，每个螺旋上的茎、环存在不同程度的差异，通过这些差异可以将白扁豆与其常见混伪品明显区分。主要区别点有：中心环大小，螺旋之间的夹角，螺旋上环的数量和大小，螺旋长度等。

图4 白扁豆及其混伪品ITS2序列二级结构比较4 讨论

在长期栽培过程中，白扁豆在外观形态上发生了较大的变化，比如，表面有黑色斑点，性状和大小差异较大，这些变化虽不成为种的鉴别依据，但也可能会对经验不足的鉴定和使用人员造成困扰。据文献［9-12］报道，目前白扁豆发现的混伪品主要有金甲豆、眉豆、镰扁豆以及菜豆、荷包豆等；在植物分类中，扁豆属（Lablab）和硬皮豆属（Macrotyloma）二者非常相似，曾一起被归入Dolichos 属，如白扁豆Lablab purpureus 拉丁学名原为Dolichos lablab；硬皮豆Macrotyloma uniflorum(Lam.) Verdc.拉丁学名原为Dolichos unifloraLam.［13］，因此，这些均为白扁豆易混伪或近缘品种。还有观点认为“进口扁豆”系伪品，不可入药［14］。此外，目前《中国药典》2020 年版收载的白扁豆项目仅有性状和显微鉴别，无化学成分鉴别指标，不易将白扁豆与其混伪品区分。

鉴于以上原因，需要采用更多的手段或指标对市售白扁豆进行分析，本研究采用基于ITS2 序列的DNA 条形码技术对白扁豆的遗传背景情况进行了较为深入的分析。从ITS2 序列来看，白扁豆ITS2 序列可与其近源种有效区分，但不同地域栽培的白扁豆以及国产和进口白扁豆未发现明显的差异，可能原因是这些均为白扁豆的不同栽培类型，遗传背景差异很小。本研究表明，白扁豆ITS2 序列变异小，仅有两个变异位点。王明芳等［15］也曾报道进口白扁豆与国产白扁豆仅在外观性状上存在差异，但在显微鉴别、薄层鉴别及健脾止泻功效方面未表现出明显的差异，说明进口白扁豆与国产白扁豆差异很小。

虽然ITS2 序列可以作为白扁豆真伪鉴别的一个指标，但能否作为白扁豆质量评价的指标，还有待进一步的研究。因有报道认为，白扁豆与其变种云南、四川白扁豆在蛋白黏度、紫外吸收和薄层色谱等方面存在较大差异［16］；国产白扁豆星状细胞胞腔内有棕色内含物，进口品种则无此特征［15］。因此，还需要深入研究，寻找白扁豆的标记物，对白扁豆的真伪优劣进行鉴别。