卵巢早衰患者颗粒细胞关键LncRNAs的生物信息学分析

熊仪，黄婷婷，麦哲芬，霍少川，韩霞

(广州中医药大学深圳医院(福田)，广东 深圳 518000)

卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)是指女性在40岁之前发生的卵巢功能衰退，以促性腺激素水平升高和雌二醇水平降低为特征的临床综合征，常伴有月经不调、潮热、盗汗、脱发、皮肤黏膜干燥、性欲减退、焦虑等多种围绝经期症状[1]。据统计，POF的发病率为1%～3.8%，呈逐年升高且低龄化趋势，使女性提前进入绝经状态，严重影响了妇女生殖健康及生活质量[2]。

颗粒细胞是卵泡重要的组成部分，通过细胞间的相互作用，对卵泡膜细胞和卵母细胞发育、成熟及分泌功能起重要的调控作用。颗粒细胞凋亡诱导卵母细胞凋亡，卵母细胞过多闭锁，使卵巢储备功能下降，进而造成卵巢功能不全[3]。长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNAs)是一类转录本长度超过200 nt的RNA，在调节基因表达、生命发育及疾病发生发展中起重要调控作用。LncRNAs可能参与女性卵泡发育、卵丘扩张、卵子成熟和黄体形成等多个过程，影响颗粒细胞的增殖、迁移和凋亡，并且参与其调控内分泌和代谢过程[4-5]。但LncRNAs影响POF的具体作用机制及靶点尚不清楚，因此，本研究以颗粒细胞的差异表达LncRNAs为切入点，采用基因本体论(gene ontology，GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集分析探讨POF的潜在发病机制和治疗作用靶点。

1 材料和方法

1.1 资料来源

在GEO数据库(gene expression omnibus,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下载与POF相关的基因芯片数据(GSE135697)，筛选条件：(1)POF；(2)人类；其中GSE135697芯片数据中包含正常颗粒细胞样本10例、卵巢早衰颗粒细胞样本10例。以上数据集都是基于GPL16956平台的GEO数据库下载。

1.2 差异表达基因筛选

GEO2R( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)是GEO数据库提供的一个基于R语言的在线分析程序(R3.2.3版本)，用GEO2R中的Bioconductor R包对GSE135697数据进行背景矫正、归一化和表达值计算，并利用其中的limma 3.26.8包计算两组间的差异表达LncRNAs，导出GEO2R处理后的数据，设定矫正后P值(Padj)<0.01，表达变化幅度≥两倍的(|log2FC|≥1.0)为筛选差异基因的标准，其中log2FC≥1.0代表LncRNA表达上调，log2FC≤-1.0代表下调。最终得出POF组以及健康对照组的差异表达LncRNAs，即POF差异表达LncRNAs。

1.3 预测LncRNA结合的miRNA

将GEO2R分析处理后的数据根据设定的筛选标准得到上调及下调的差异表达LncRNAs，分别与mircode数据库(http://www.mircode.org/)中的“Highly conserved microRNA families”数据集进行对比分析，得出与差异表达LncRNAs潜在结合的miRNA。

1.4 miRNA靶基因的预测

将1.3筛选得到的差异表达LncRNAs潜在结合的miRNA分别输入在线miRNA靶基因预测网站miRDB、miRTarBase、TargetScan进行靶基因预测，并进一步通过Cytoscape 3.7.2软件得到差异表达LncRNAs-miRNA-mRNA的内源竞争RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)交互作用网络模型。

1.5 靶基因GO与KEGG富集分析

将1.4中预测得到的靶基因输入DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)，选择物种为人类(Homo sapiens)，进行GO和KEGG富集分析。其中GO分析主要包括差异基因的细胞组分、分子功能和生物学过程。以P<0.05进行靶基因筛选，分析潜在靶基因的生物过程及主要信号通路；在R软件(Version R x64 3.5.1)中使用Bioconductor-pathview建立通路图。

2 结果

2.1 差异表达LncRNAs筛选

根据条件设定，研究来源于芯片数据集GSE135697的POF患者颗粒细胞样本10例[年龄为(30.47±3.70)岁]和正常健康成年女性颗粒细胞样本10例[年龄(28.97±3.58)岁]，样本基线特征见表1。参照筛选标准，在GSE135697数据集中筛选出1 110个差异表达LncRNAs，其中包括905个上调LncRNAs及205个下调LncRNAs，分别对GSE135697中的差异表达基因根据Padj筛选前50个显著性意义最大的差异表达LncRNAs绘制热图(图1)。利用在线分析网站ClustVis(https://biit.cs.ut.ee/clustvis/)对筛选得到的差异表达LncRNAs进行热图绘制以及聚类分析，将GEO2R处理后的数据中的Padj进行-lg转换，并根据log2FC将-lg(Padj)进行分组(上调LncRNAs组、下调LncRNAs组、差异无统计学意义LncRNAs组)，将-lg转化后的数据导入GraphPad Prism 7中绘制火山图(图2)。

表1 样本基线特征表

图1 POF前50个差异表达LncRNAs的聚类热图

FC差异倍数；Padj矫正后P值图2 POF差异表达LncRNAs火山图

2.2 预测LncRNAs结合的miRNA

利用mircode数据库对芯片GSE135697数据集进行差异分析得到的前50个差异表达LncRNAs与之结合的miRNA进行预测，其中发现8个差异表达LncRNAs与206个miRNA存在结合关系，具体对应关系见表2。

表2 差异表达LncRNAs潜在结合的部分miRNA

2.3 ceRNA网络构建

利用差异表达LncRNAs得出miRNA后进行靶基因预测，并将三个数据库同时预测得到的mRNA作为潜在靶基因，最终得到1 269个潜在靶基因，结果见表3，并绘制差异表达LncRNAs-miRNA-mRNA的ceRNA交互作用网络模型(图3—4)。

表3 miRNA 部分靶基因预测

A hsa-miR-107；B hsa-miR-17-5p；C hsa-miR-24-3p；D hsa-miR-20b-5p；E hsa-miR-125a-5p；F hsa-miR-27a-3p图3 ceRNA交互网络

图4 靶基因蛋白-蛋白互作网络

2.4 靶基因GO及KEGG通路富集分析

运用DAVID数据库分别对潜在靶基因进行GO和KEGG通路富集分析，发现核心基因的GO功能主要涉及金属离子跨膜转运蛋白活性、DNA与转录因子结合能力、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性等(图5—6)。KEGG通路富集分析结果(只显示富集结果前20位的通路)可见潜在靶基因的KEGG通路主要涉及磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、Ras相关蛋白1(ras-related protein 1，Rap1)、Ras蛋白(rat sarcoma，Ras)、钙离子信号通路等(图7—8)。

图6 GO功能富集分析气泡图

图7 靶基因KEGG通路富集分析柱状图

图8 靶基因KEGG通路富集分析气泡图

3 讨论

卵泡是卵巢的基本功能单位，由卵泡细胞和发育中的卵母细胞组成，具有分泌激素和促进卵母细胞发育的功能，决定雌性动物的繁殖性能和生殖健康[6]。颗粒细胞作为卵泡体主要的功能细胞，是卵巢的基础功能单位，参与卵泡发育、成熟及排卵的整个过程[7]。颗粒细胞在闭锁卵泡中的凋亡早于卵母细胞和膜细胞，是卵泡闭锁的发起者，颗粒细胞凋亡可以引起卵泡闭锁，最终导致POF[8]。

本研究筛选的POF颗粒细胞前8个差异表达LncRNAs包括EPN1、PDLIM3、FAM126B、PPM1K、CAMTA1、EIF4ENIF1、LINC00222和TMSB4X。经筛选的差异表达LncRNAs可能结合的miRNA有hsa-miR-17-5p、hsa-miR-301b-3p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-107、hsa-miR-20b-5p、hsa-miR-338-3p、hsa-miR-125a-5p等。其中hsa-miR-17-5p的靶基因为MKNK2、RPA2、GOLGA1、KIAA1191，hsa-miR-301b-3p的靶基因为SERINC3，hsa-miR-125a-5p的靶基因为ANAPC16，hsa-miR-107的靶基因为DHX33，hsa-miR-20b-5p的靶基因为DYNC1LI2，hsa-miR-338-3p的靶基因为ACVR1，hsa-miR-125a-5p的靶基因为IRF4，并进一步构建其ceRNA网络。本研究筛选的差异表达LncRNAs、预测的miRNA和靶基因在POF颗粒细胞中的表达及相互作用关系尚未进行验证，将在后续实验中进行验证并进行功能研究。

本研究筛选的POF颗粒细胞差异表达LncRNAs的功能主要与金属离子跨膜转运蛋白活性、DNA与转录因子结合能力、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性等相关，涉及PI3K-Akt、MAPK、Rap1、Ras、钙离子信号通路等。研究表明，卵母细胞中的PI3K信号通路控制着原始卵泡的存活、丢失和活化，雌激素受体α以配体依赖性方式与PI3K的调节亚基p85α结合，诱导PI3K活性，从而激活Akt[9]。MAPK通路可介导细胞膜表面到细胞核的细胞外信号，调节细胞增殖、分化、存活和死亡[10]，激活MAPK通路能够抑制颗粒细胞增殖并加速细胞衰老[11]。在卵泡发育后期，Rap1信号通路能促进卵泡边缘细胞迁移、极化、黏附，使其成为优势卵泡[12]。Ras信号通路对于排卵和黄体生成至关重要，Ras被激活后颗粒细胞就不可逆转地排卵并最终分化为黄体细胞[13]。钙离子是调节细胞功能的主要信号分子之一，生理水平钙离子浓度能够恢复卵母细胞减数分裂和中期 II (M-II)停滞，超生理范围钙离子浓度可触发活性氧产生，诱导卵母细胞凋亡[14]。

综上，POF颗粒细胞差异表达的LncRNAs具有金属离子跨膜转运蛋白活性、DNA与转录因子结合能力、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性等功能，涉及PI3K-Akt、MAPK、Rap1、Ras、钙离子等多条信号通路。颗粒细胞LncRNAs异常表达与POF的发生存在密切关联，为POF的研究和治疗提供了重要的生物分子靶标。