气相色谱法测定盐酸平阳霉素原料及其制剂中的残留溶剂

韩彬?徐艳梅?周玉岩?李佳蕊?高燕霞

摘要：目的 建立顶空进样-气相色谱法测定盐酸平阳霉素原料及其制剂中有机溶剂残留量，同时对国产样品质量现状进行评价。方法 采用气相色谱法，顶空进样；色谱柱为DB-624毛细管柱（60 m×0.53 mm， 3.0 μm），载气为高纯氮气，程序升温，氢火焰离子化检测器（FID），进样口温度为200℃，检测器温度为 230℃，载气流速为 5.0 mL/min，分流比为 10：1，进样量1 mL。结果 盐酸平阳霉素原料中可检出甲醇、丙酮、异丙醇3种溶剂；应用经验证的新方法对征集到的原料进行测定，其中一厂家的3批产品批间差异非常小，提示其生产工艺稳定，另一厂家的产品检出的丙酮含量超出国家限定值范围。 注射用盐酸平阳霉素中有机溶剂残留量远低于限度要求。结论 该方法操作简单、快速灵敏、结果准确，可通过对盐酸平阳霉素有机溶剂残留量的测定，对药品生产的工艺控制水平进行评估。建议我国药品生产企业在内控标准中增订残留溶剂检查项，并开展周期性地检验，及时发现生产中的质量波动情况；注射用盐酸平阳霉素采用冷冻干燥工艺生产，因而不需控制残留溶剂。

关键词：盐酸平阳霉素；残留溶剂；质量分析；工艺控制

中图分类号：R978.1文献标志码：A

Abstract Objective To establish a headspace sampling-gas chromatography method for the determination of residual organic solvents in bleomycin A5 hydrochloride， and to evaluate the quality status of domestic raw materials and powder for injections. Methods Gas chromatography and headspace injection were used. The chromatographic column was a DB-624 capillary column （60 m×0.53 mm， 3.0 μm） with high purity nitrogen as carrier gas， temperature programmed， hydrogen flame ionization detector （FID）， injection port temperature of 200℃， detector temperature of 230℃， carrier gas flow rate of 5.0 mL/min. The shunt ratio was 10：1， and the injection volume was 1 mL. Results Three solvents， methanol， acetone and isopropanol， were detected in the raw material of Bleomycin A5 hydrochloride. The new verified method was used to determine the collected raw materials. The difference between the three batches of products from one manufacturer was very small， indicating that the production process was stable. The residual amount of organic solvent in bleomycin A5 hydrochloride for injection is far below the limit requirement. Conclusion The method is simple， rapid， sensitive， and accurate. It can be used to evaluate the process control level of drug production by determining the residual organic solvent of bleomycin A5 hydrochloride. It is suggested that Chinese drug manufacturers should add residual solvent inspection items in the internal control standards， and carry out periodic inspection to discover the quality fluctuation in production in time. It is not necessary to control the residual solvent of bleomycin A5 hydrochloride for injection， which is produced by freeze drying process.

Key words Bleomycin A5 hydrochloride; Residual solvent; Quality analysis; Process control

盐酸平阳霉素，又名争光霉素是我国由平阳链霉菌发酵液中分离，并自主研发的抗肿瘤类抗生素[1]，制剂注射用盐酸平阳霉素为盐酸平阳霉素冻干品。临床上主要用于治疗唇癌、舌癌、齿痕癌和鼻咽癌等颈部鳞癌[2]，其主成分化学结构与博来霉素A5组分一致，但肺毒性低于博来霉素[3]，同时本品不抑制机体的免疫功能，无常用抗癌药物所引起的白细胞减少症状，且价格低廉，是優良的进口抗癌药物替代品种。1994年进入首批国家基本药物目录，现行质量标准收载于《中国药典》2020年版二部[4]。

盐酸平阳霉素发酵液中伴生多种杂质[5]，生产过程需要多次提纯，其工艺的稳定性直接影响产品的质量。提纯中使用到的有机溶剂主要有甲醇、丙酮和异丙醇3种，然而现行质量标准中未对残留溶剂做出要求，检索近年文献，亦无相关报道。

残留溶剂的评估是原料生产过程控制的重要环节。本文根据人用药物注册技术要求国际协调会（ICH）的相关规定和《中国药典》2020年版四部通则 0861“残留溶剂测定法” 的要求，采用气相色谱法测定盐酸平阳霉素原料中3种有机溶剂的残留量，进而评估盐酸平阳霉素原料的生产工艺稳定性，同时用建立的方法考察注射用盐酸平阳霉素中有机溶剂残留情况，为检查项目设置必要性提供数据支持。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

安捷伦7890B气相色谱仪；氢火焰离子化检测器（FID）；纯水氢气发生器（济南浩伟实验仪器有限公司）；SGK-2LB低噪空气泵（北京东方精华苑科技有限公司）；Open LBACDS Chem Station Edition工作站；德国梅特勒XS205电子分析天平。

1.2 药品与试剂

盐酸平阳霉素原料，厂家1，批号：Y190401、Y200901、Y200902；厂家2，批号：200322。注射用盐酸平阳霉素，厂家1，批号：190501、200501、200801、200901；厂家2，批号：20200424、20200519。水是实验室自制超纯水（电阻率18.2Ω）；甲醇、丙酮、异丙醇均为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Agilent DB-624毛细管色谱柱（60 m×0.53  mm，3.0 μm）；检测器为氢火焰离子化监测器（FID）；进样口温度为200℃；检测器温度为230℃；采用程序升温方式：起始柱温为40℃，维持2 min，以5℃/min的速率升温至100℃，维持8 min，再以20℃/min的速率升温至200℃，维持5 min；载气为高纯N2，柱流速为5 mL/min；顶空瓶平衡温度设定为70℃，顶空平衡时间30 min。

2.2 溶液配制

混合对照品贮备液：精密称取甲醇1.50 g、丙酮2.50 g、异丙醇2.50 g，分置50 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀；精密量取上述3溶液各5 mL置同一50 mL量瓶中。用水稀释至刻度，摇匀，即得含甲醇、丙酮、异丙醇分别为3、5和5 mg/mL 的混合对照品贮备液。

对照品溶液：精密量取混合对照品贮备液5 mL，置50 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取2 mL置顶空瓶中，密封，即得。

供试品溶液：精密称取供试品0.2 g，置顶空瓶中，精密加入水2 mL溶解，密封，即得。

2.3 专属性试验

精密量取“2.2”项下混合对照品溶液、空白溶液（水）和供试品溶液，照“2.1”项下方法测定，记录色谱图（图1）。在该色谱条件下，出峰顺序依次为：甲醇（4.713 min）、丙酮（6.683 min）和异丙醇（6.896 min），各色谱峰分离度均大于1.5；理论板数均大于50000，溶剂对样品测定无干扰，其它杂质峰对测定无干扰。

2.4 检出限及定量限测定

精密量取混合对照品溶液，逐级稀释，照“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱峰高并与信噪比（S/N）比较，当峰高约为10倍的S/N时，该供试品浓度即为定量限（LOQ）；当约为3倍的S/N时，即为检出限（LOD）。检测结果见表1。

2.5 线性关系考察

精密量取混合对照品贮备液各0.1、0.5、1、2和5 mL分别置于10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，摇匀，制成系列标准曲线混合对照测试溶液。精密量取2 mL置顶空瓶中，密封，按“2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积。以溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，分别得到甲醇、丙酮、异丙醇的标准曲线线性回归方程及线性范围，结果见表2。

2.6 准确度试验

精密量取混合标准贮备液0.8、1.0、1.2置10 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得标准加入液（1）、（2）、（3）；精密称取盐酸平阳霉素原料（批号：Y200901）0.2 g，共9份，分3组，置顶空瓶中，分别加入上述混合对照溶液2.0 mL，密封。照“2.1”项下测定，记录色谱图；以峰面积，按外标法，测定甲醇、丙酮和异丙醇的回收率（表3），测定结果提示方法的准确性良好。

2.7 精密度试验

2.7.1 进样精密度试验

取对照品溶液注入气相色谱仪，记录色谱图。重复进样6次，计算RSD，考察本法的仪器精密度。结果：甲醇保留时间RSD为0.01%，峰面积RSD为1.0%，丙酮保留时间RSD为0.0%，峰面积RSD为0.7%，异丙醇保留时间RSD为0.01%，峰面积RSD为0.8%，进样精密度良好。

2.7.2 重复性试验

取盐酸平阳霉素原料1批（批号：Y190401）和混合对照品贮备溶液，照拟定方法，平行制备6份，考察本法的重复性。结果：同一实验人员重复测定6次，6次测定结果比较甲醇、丙酮和异丙醇的检出量一致。方法重复性良好。

2.8 溶液稳定性试验

按对照品溶液配制方法制备，于室温放置0、1、2、3、4、5和6 h，取不同放置时间的上述溶液注入气相测定，结果：室温放置6 h，对照品溶液中甲醇、丙酮和异丙醇峰面积RSD分别为4.1%、1.6%和1.9%（n=7），对照品溶液在6 h内稳定。

2.9 耐用性试验

分别考察了载气流速3.0、4.0和5.0 mL/min；进样口温度180℃、200℃和220℃和检测器温度210℃、230℃和250℃，以及分流比5：1、10：1条件下3种有机溶剂的色谱保留行为，结果见表4。在各色谱条件下甲醇、丙酮和异丙醇3种溶剂分离度及理论塔板数均符合要求，提示本方法色谱条件的耐用性良好。

2.10 样品测定

取盐酸平阳霉素原料4批（批号：Y190401、Y200901、Y200902和200322）和注射用盐酸平阳霉素6批（190501、200501、200801、200901、20200424和20200519），每份0.2g，按“2.1”项下方法测定，记录峰面积，外标法计算有机溶剂残留量，结果见表5。

3 讨论

3.1 色谱条件筛选

盐酸平阳霉素易溶于水，待测3中有机溶剂与水溶解度良好，因此选择水为溶剂；甲醇、丙酮和异丙醇的沸点分别为64.8℃、56.5℃和82.4℃，沸点均低于水的沸点，因而选择顶空进样。取供试品溶液，固定加热时间30 min，分别考察50℃、60℃、70℃、80℃和90℃顶空条件下，待测组分峰面积变化及降解杂质对测定的干扰情况。实验发现，在70℃条件下，各待测组分均有良好相应，且降解杂质对测定无影响，因此确定顶空温度为70℃。取混合对照品溶液，固定頂空温度为70℃，分别考察加热10、20、30、40和50 min时待测溶液的气液平衡状态。实验发现，30 min后，各组分峰面积趋于稳定，以30 min分离度最好，且检测周期适宜，因此确定顶空条件为70℃，加热30 min。

3.2 样品分析

通过微生物发酵工艺或半合成过程生产的抗生素，组分较复杂，生产工艺中常用有机溶剂对粗品进行结晶提纯，如果工艺参数控制不严格，成品中残留有机溶剂的量将出现较大变异，因此，以残留溶剂是表征提纯工艺稳定性的重要指标之一。对征集到的两个厂家4批原料药的检测结果提示，一个厂家的样品均符合《中国药典》四部通则0831残留溶剂测定[6]中的限度要求，且3批批间差异非常小，提示其生产工艺稳定。另一个企业的样品，丙酮含量超过国家标准限度近一倍，但由于仅有一批样品，无法评价其工艺稳定性。虽然在两个企业的6批制剂中，残留溶剂均未被检出或残留量较低，其原因为注射用盐酸平阳霉素采用冷冻干燥工艺生产，原料中的低沸点溶剂在制剂过程中可以被去除。但企业内控质量标准中设立残留溶剂检查项，并周期性地进行测定，对评估生产工艺的仍稳定性具有重要意义。

3.3 小结

残留溶剂与原料提纯工艺密切相关。对其残留量进行分析，可以体现出药品生产企业的工艺控制水平，同时也暴露出不同企业间生产工艺的差距。建议我国药品生产企业制订内控质量标准，并周期性地开展检验，以便及时发现生产中的质量波动情况，注射用盐酸平阳霉素残留溶剂检出量远远低于标准限度，标准中无需增加残留溶剂检查项。

参 考 文 献

张瑞， 许鸿章， 娄志贤. 争光霉 素的研究[J]. 微生物学报， 1980， 20（1）： 76-81.

许鸿章， 张鹤镛. 平阳霉素的分离和鉴别[J]. 药学学报， 1980， 15（10）： 609-614.

甄永苏， 李电东. 抗肿瘤抗生素平阳霉素研究与临床应用40年[J]. 中国抗生素杂志， 2009， 34（10）： 577.

国家药典委员会. 中华人民共和国药典[S]. （2020年版二部）. 北京： 中国医药科技出版社， 2020： 1085-1087.

虞惺， 许永寿， 李妙儿. 平阳霉素发酵中若干问题的探讨[J]. 抗生素， 1979， （3）： 7-14.

国家药典委员会. 中华人民共和国药典[S]. （2020年版四部）. 北京： 中国医药科技出版社， 2020： 116-120.