西藏自治区鼠疫自然疫源地鼠疫耶尔森菌最低抑菌浓度的测定及研究

杨晓艳?辛有全?何建?靳娟?李胜?张琪?吴海莲?柏吉祥?金泳?代瑞霞

摘要：目的 根据美国临床和实验室标准协会（CLSI）药敏试验方法中的琼脂平板稀释法，对分离自西藏自治区鼠疫自然疫源地内的164株鼠疫耶尔森菌进行抗菌药物最低抑菌浓度的测定，监测西藏地区耐药鼠疫耶尔森菌株，掌握其抑菌范围，为鼠疫的临床治疗提供基础数据。方法 利用琼脂平板稀释法分别测定氧氟沙星、环丙沙星、复方磺胺甲恶唑（甲氧苄啶-磺胺甲恶唑）、硫酸卡那霉素、链霉素、头孢曲松钠、氨苄青霉素钠、氯霉素、盐酸壮观霉素、头孢呋辛钠、盐酸四环素、莫西沙星共12种抗生素对164株鼠疫耶尔森菌的最低抑菌浓度（MIC）。若发现耐药菌株，则用K-B法进行验证。结果 所测的164株鼠疫耶尔森菌中有1株对链霉素具有耐药性（MIC=4096 μg/mL），链霉素K-B法检测抑菌环直径为0，这株菌对其余11种抗菌药物均敏感。其余163株菌对12种抗生素均敏感。结论 发现1株鼠疫耶尔森菌对链霉素具有耐药性，这是我国首次发现鼠疫耶尔森菌对链霉素耐药。因链霉素是国内外治疗鼠疫的首选药物，耐药鼠疫耶尔森菌会引起链霉素治疗失败，从临床和公共卫生的角度来看，对鼠疫耶尔森菌分离株的抗菌敏感性监测应常规开展。

关键词：耐链霉素鼠疫耶尔森菌株；西藏自治区鼠疫自然疫源地；最低抑菌浓度

中图分类号：R978.1      文献标志码：A

Abstract Objective According to the AGAR dilution method of drug sensitivity test method of the clinical and laboratory standards institute （CLSI）， the minimal inhibitory concentration （MIC） of antimicrobial agents against Yersinia pestis isolated from plague natural foci in Tibet Autonomous Region was determined to monitor drug-resistant Yersinia pestis strains and master their inhibition range， so as to provide basic data for clinical treatment of plague. Methods The MIC of 12 antibiotics （ofloxacin， ciprofloxacin， trimethoprim-sulfamethoxazole， kanamycin sulfate， streptomycin， ceftriaxone sodium， ampicillin sodium， chloramphenicol， spectinomycin hydrochloride， cefuroxime sodium， tetracycline hydrochloride， and moxifloxacin） against 164 strains of Yersinia pestis were determined by the AGAR dilution method. If the resistant strain was found， the K-B method was used to verify the strain. Results One of 164 Yersinia pestis strains tested was resistant to streptomycin （MIC= 4096 μg/mL）， and the diameter of inhibition ring detected by the streptomycin K-B method was 0. The strain was sensitive to the other 11 antibiotics. The other 163 strains were all sensitive to the 12 antibiotics. Conclusion     One strain of Yersinia pestis was found to be resistant to streptomycin， which was the first time that Yersinia pestis was found to be resistant to streptomycin in China. Since streptomycin is the preferred drug for the treatment of plague at home and abroad， drug-resistant Yersinia pestis can cause streptomycin treatment failure. From the perspective of clinical and public health， the antimicrobial susceptibility monitoring of Yersinia pestis isolates should be carried out routinely.

Key words Streptomycin resistance Yersinia pestis; Natural plague Foci in Tibet; Minimum inhibitory concentration

西藏自治區作为青藏高原的主体部分，1966年被证实为喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地[1]，它也是青藏高原喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地的重要组成部分。该鼠疫自然疫源地是我国乃至世界鼠疫流行最为活跃的地区之一[2]。1999年以来藏南地区就新增了11个疫源县[3]。近年来，滥用抗生素一直是全世界面临的公共卫生问题，从而导致了耐药细菌的大量出现。鼠疫耐药菌株比较罕见，已报道在马达加斯加发现了2株分离自人体的耐药鼠疫耶尔森菌株和1株分离自动物体内的鼠疫耶尔森菌株，其中人体的一株菌为多重耐药菌株[4-6]，耐药鼠疫耶尔森菌株的出现使得鼠疫临床治疗面临着新的挑战。为了解西藏自治区鼠疫耶尔森菌对临床常用药物的耐药情况，笔者选择鼠疫治疗、预防的药物及临床常用药等12种抗菌药物，测定这些药物对西藏自治区鼠疫耶尔森菌的最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration， 以下简称MIC），为鼠疫的临床治疗提供基础数据，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验菌株、主要试剂与仪器

1.1.1 实验菌株

被试菌株为1966—2008年间西藏自治区鼠疫自然疫源地分离自39个疫源县（市）的164株代表性鼠疫耶尔森菌株（详见表1）、鼠疫耶尔森菌标准株141及质控菌株ATCC25922，均由青海省地方病预防控制所提供。

1.1.2 主要试剂

琼脂粉、牛肉粉、可溶性淀粉、酸水解酪蛋白及12种抗生素均购自北京中生瑞泰科技有限公司，赫氏培养基购自北京陆桥有限公司。

1.1.3 主要仪器

MIC多点接种仪（天津市恒奥科技发展有限公司），细胞密度仪（英国Grant Bio）。

1.2 方法

按照美国临床和实验室标准化协会（CLSI）推荐的琼脂平板稀释法对鼠疫耶尔森菌的MIC进行抗菌药物的测定。

1.2.1 抗菌药物储备液配制

（1）氧氟沙星、环丙沙星、磺胺甲恶唑：先加1/2体积灭菌去离子水，然后逐滴加入1 mol/L NaOH至溶解后，再用灭菌去离子水定容，均配制成浓度为10 mg/mL的储备液。

（2）硫酸卡那霉素、硫酸链霉素、头孢曲松钠、氨苄青霉素钠、盐酸壮观霉素、头孢呋辛钠、莫西沙星：直接用灭菌去离子水溶解，均配制成浓度为10 mg/mL的储备液。

（3）盐酸四环素：直接用灭菌去离子水溶解，配制成浓度为5 mg/mL的储备液。

（4）氯霉素：直接用95%乙醇溶解，配制成浓度为10 mg/mL的储备液。

（5）甲氧苄啶：用灭菌去离子水加10%终体积的0.05 mol/L盐酸，配制成浓度为2.5 mg/mL的储备液。

配制好的储备液储存于-20℃冰箱中备用。

1.2.2 培养基制备

用灭菌去离子水将13种药物的储备液对倍稀释成所需浓度，加入到已灭菌的定量M-H琼脂培养基中，制备成含抗菌药物终浓度为0.004、0.008、0.015、0.031、0.062、0.125、0.25、0.50、1、2、4、8、16、32、64、128、256、512、1024和4096 μg/mL的含药平皿。

1.2.3 细菌接种

将被试菌株28℃、24 h培养后，按照何建等[7]鼠疫耶尔森菌最低抑菌浓度测定方法的建立与应用中的方法用MIC多点接种仪进行接种。在接种含抗菌药物平皿前及接种完成后分别接种一个不含抗菌药物的M-H质控平皿以检查接种菌株生长性的纯度。将接种好的平皿置37℃温箱培养24～48 h。

1.2.4 结果观察

将培养好的平皿置于不反光的表面上观察被试菌株是否生长。当质控菌株的MIC在质控范围内时，记录完全抑制细菌生长的最低抗菌药物浓度（MIC）。当出现单个菌落或接种物所致的轻微的不清晰现象时可判为未生长；当出现耐药性菌株生长时重复此方法至少3次以上。

1.3 纸片扩散法

按照美国CLSI[8]推荐，使用药敏纸片检测耐链霉素鼠疫耶尔森菌、鼠疫标准株141及ATCC 25922对链霉素的药敏性，当出现耐药性菌株时（未出现抑菌环）重复此方法至少3次以上。

2 结果

2.1 鼠疫耶尔森菌株耐药性测定

164株测试菌株中未发现除链霉素外对其它11种抗生素具有单个或多个抗菌药物抗性的鼠疫耶尔森菌株，但有1株鼠疫耶尔森菌对链霉素具有耐药性，详见表2和图1。

2.2 纸片扩散法结果

根据美国CLSI[8]药敏纸片法判定標准（耐药≤11 mm，中度敏感为12～l4 mm，敏感≥15 mm），其中1#平皿为耐链霉素鼠疫耶尔森菌株（未出现抑菌环），2#平皿为鼠疫标准株141（抑菌环直径为27.7 mm），3#平皿为质控菌株ATCC 25922（抑菌环直径为25.1 mm），详见图2。

3 讨论

本次研究对1966—2008年间分离自西藏自治区的164株野生鼠疫耶尔森菌进行MIC测定，其中163株鼠疫耶尔森菌中未发现对除链霉素外对其它11种抗生素具有单个或多个抗菌药物抗性的鼠疫耶尔森菌株。但有1株鼠疫耶尔森菌对链霉素具有耐药性，这株菌分离自1996年西藏自治区隆子县加玉乡四村一起人间疫情人尸体内，现保藏于青海省地方病预防控制所鼠疫菌专业实验室。表现出了对链霉素的高度耐药性（MIC=4096 μg/mL），链霉素对鼠疫耶尔森菌的耐药标准为MIC≥16 μg/mL，远超耐药标准，该菌对所测的其余11种抗菌药物均敏感，这是在我国鼠疫自然疫源地野生鼠疫耶尔森菌株中首次发现的对链霉素耐药的鼠疫耶尔森菌株。结合流行病学调查、临床症状和患者治疗情况，推断是由于临床大量使用链霉素治疗患者引起患者携带菌株出现耐药现象。链霉素对鼠疫耶尔森菌有很强的杀菌作用，自20世纪40年代末期以来，一直作为治疗鼠疫的首选药物[9]，链霉素耐药菌株的发现，警示我们研究新型、高效和低毒的抗菌药物应用于鼠疫临床是下一步十分迫切与必要的工作。而本次研究从表型特征上发现的耐链霉素鼠疫耶尔森菌株的耐药机制有待进一步研究。

代瑞霞等[10]在1943—2016年分离自我国鼠疫自然疫源地的2753株鼠疫菌中均未检测到链霉素、β-内酰胺类抗菌药及磺胺类药物耐药基因及耐消毒剂基因，而何建等[11]采用PCR法检测西藏自治区鼠疫耶尔森菌耐药质粒时也未发现携带耐链霉素质粒的现象，以上两项研究中均包括此次实验中发现的这株耐链霉素鼠疫耶尔森菌，但检测方法只是针对外源耐药质粒的检测，故未在检测菌株中发现有获得性耐药质粒的菌株。而在本次研究中通过表型特征的测定却发现了耐链霉素鼠疫耶尔森菌株，说明随着抗菌药物的广泛使用及全球化推进，鼠疫耶尔森菌耐药性的产生是必然趋势，且不能仅通过一种方法就能筛选出耐药菌株，而是应该通过多种多次的检测方法和实验操作来进一步确认。

1995年法国巴斯德研究所科学家Galimand等[4]在马达加斯加分离了1株耐链霉素鼠疫耶尔森菌 No. 16/95，随后的研究证实，对链霉素具有强耐受性的鼠疫耶尔森菌No.16/95中存在着质粒PIP1203，该质粒长40 kb，可在鼠疫耶尔森菌、假结核耶尔森菌中高频传递，在鼠疫耶尔森菌、大肠埃希菌中以较低的频率传递，其质粒上携带有氨基糖甙类酰基转移酶基因，能作用于氨基糖的特定羟基，使其磷酸化，导致了耐药性的出现[12]。

西藏自治区属青藏高原喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地，是全国受鼠疫威胁最严重的省（自治区）之一。1966年首次证实鼠疫存在以来，共发生人间鼠疫22起，发病120人，死亡75人，平均死亡率为62.5%[13]。西藏自治区鼠疫自然疫源面积广，动物间鼠疫流行猛烈，本研究结果发现的链霉素耐药菌株为人间疫情人尸体所分离，耐药性极强（MIC=4096 μg/mL），这对我国鼠疫的临床治疗提出了新的研究课题。因此，将抗菌药物对鼠疫耶尔森菌最低抑菌浓度测定方法，纳入到鼠疫耶尔森菌常规的表型研究中，了解西藏自治区乃至中国各鼠疫自然疫源地鼠疫耶尔森菌对抗菌药物的耐药情况，掌握常用抗菌药物对鼠疫耶尔森菌的MIC势在必行。

参 考 文 献

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