复合杂合突变导致的遗传性凝血因子XI缺陷症家系分析

郭跃丽，雷晓芳，郑温洁莹，孔万仲，奚经巧，王明山

凝血因子XI（FXI）是一种丝氨酸蛋白酶原，主要在肝脏和巨核细胞中合成[1]，其参与内源性凝血途径，在正常止血过程中起重要作用[2]。遗传性FXI 缺陷症是由FXI 基因（F11）突变导致FXI 水平降低的遗传性凝血系统异常性疾病，呈常染色体隐形遗传，主要表现为创伤或手术后出血增多，自发性出血情况少见，但FXI 活性（FXI：C）水平高低与出血的严重程度相关性不高[3-4]。本文通过对一个遗传性FXI缺陷症患者家系的临床表型及基因突变的分析，初步探讨其分子致病机制，报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 先证者，女，45 岁，汉族，因“眩晕综合征”，于2021 年9 月入住温州市中医院神经内科治疗。凝血常规检查发现活化部分凝血活酶时间（APTT）为85.9s（正常值参考值：29.0 ～43.0 s）、血浆凝血酶原时间（PT）为13.3 s（正常值参考值：12.8 ～14.5 s）。进一步检测发现FXI：C 为2%（正常值参考值：82%～118%）、FXI抗原（FXI：Ag）为4.8%（正常值参考值：90.0%～100%），其他凝血指标均无异常，肝、肾功能正常，平素无明显自发性出血症状，但因夏季蚊叮虫咬，皮肤破损后结痂愈合缓慢。其父母非近亲婚配，家系其他成员（共3 代13 人）均无自发性出血症状。家系遗传图谱见图1。另收集140 例体检健康者，其中男95 例，女45 例；年龄21 ～48岁；无肝、肾功能异常，无出血及血栓史，无抗凝剂用药史，女性无口服避孕药。本研究经温州市中医院伦理委员会批准（WZY2022-LW-018-01）。

图1 遗传性凝血因子XI 缺陷症家系图

1.2 标本采集与处理 采集研究对象外周静脉血2.7 ml，用0.109 mol/L 枸橼酸钠溶液1 ∶9 抗凝，3 000 r/min 离心15 min 后，取上层乏血小板血浆用于各凝血指标的检测，下层血细胞于―40 ℃冻存，用于基因组DNA 的抽提，并进行PCR 扩增及测序。

1.3 凝血指标检测 PT、APTT、纤维蛋白原（FIB）、FXI：C 等凝血指标采用一期凝固法在法国Stago STA-R全自动血凝仪上测定（配套试剂由法国STAGO 公司提供）；FXI：Ag 采用酶联免疫吸附测定法。所有操作步骤均严格按照试剂说明书进行。

1.4 引物 根据FXI基因序列（GenBankAY193837），采用Primer 5.0 软件设计覆盖F11 基因所有外显子区域及侧翼序列的13 对引物，由上海桑尼生物科技有限公司合成，见参考文献[5]。

1.5 外周血基因组DNA 提取和PCR 扩增 选用酚-氯仿法提取先证者及家系成员的外周血基因组DNA。PCR 反应体系包括2×Taq PCR MasterMix 12.55l，双蒸水8.0l，DNA 模块2.05l，10mol/L上下游引物引物各1.0l。用LifePro 热循环仪扩增，反应条件如下：95 ℃预变性5min，95℃变性30s，58 ℃退火30s，72 ℃延伸30s，共30 个循环，再72 ℃延伸10 min，4 ℃保存[6]。PCR 产物送上海桑尼生物科技有限公司进行电泳和纯化，然后使用基因测序仪进行测序。

1.6 测序分析 通过Chromas软件与美国NCBI 基因库所公布的F11 基因序列（GenBank：AY193837）进行比对，查找基因突变的位点，发现突变位点后用反向测序予以证实，缺失突变用克隆测序证实。明确先证者基因突变的位点后，再扩增其他家系成员相应突变位点区域并进行测序分析。

1.7 生物信息学技术分析

1.7.1 氨基酸序列及保守性分析 应用ClustalⅩ-2.1-win 软件对人类和NCBI 数据库中提供的其他5 种同源性物种：黑猩猩（Pantroglodytes）、家犬（Canislupus familiaris）、牛（Bos Taurus）、小家鼠（Musmusculus）、褐家鼠（Rattus norXIegicus）（同源性物种氨基酸序列来源：https：//www.ncbi.nih.goXI/homologene/104）的氨基酸序列进行比对，分析突变氨基酸的保守性。

1.7.2 生物信息学软件分析 通过2 个在线生物信息学软件MutationTaste（rhttps://www.mutationtaster.org/）和PROXIEAN（https://www.jcvi.org/research/provean），预测突变对蛋白质功能的影响。

1.7.3 分子模型构建和分析 以蛋白质数据库（https://www.uniprot.org/）中提供的三维结构（pdb：5eod）为模型，运用Swiss-PdbViewer 4.01 软件分析p.Gln263stop 对FXI 蛋白结构的影响，推测基因突变影响蛋白功能的可能机制。

2 结果

2.1 先证者及家系成员表型检测 先证者APTT明显延长，FXI：C 和FXI：Ag 较正常对照显著减低；先证者母亲、二哥、二姐、外甥女、侄子和儿子FXI：C和FXI：Ag均稍减低；家系成员的其他凝血指标均无明显异常，见表1。

表1 研究对象主要实验表型及基因检测结果

2.2 先证者及家系成员基因分析 先证者F5 基因第8 外显子存在c.841C ＞T（p.Gln263stop）杂合突变及第10 内含子3’端剪切位点突变（ IVSJ-4del gttg）。其母亲、二哥和侄子存在c. 841C ＞T（p.Gln263stop）杂合突变，其二姐、外甥女和儿子存在IVSJ-4del gttg杂合突变，其余家系成员均为野生型，见表1、图2。

图2 遗传性FXI 缺陷症患者基因测序结果

2.3 保守性分析 ClustalX软件的保守性分析结果表明p.Gln263 在同源物种间高度保守，见图3。

图3的p.Gln263 在不同物种间的多重序列比对结果

2.4 在线生物信息学软件分析 MutationTaster 和PROXIEAN在线生物信息学软件对p.Gln263stop 预测结果分别为1.00 分和―5.56 分；MutationTaster对IVSJ-4del gttg的预测结果为0.982，均显示为致病的突变，可影响蛋白质功能。

2.5 分子模型构建和分析 用Swiss-PdbViewer 4.01 软件对FⅪ突变前后的蛋白质进行模型分析，结果显示，p.Gln263stop 突变其Gln263 位后的氨基酸及Gln263 都消失，见图4。

图4 FXI 蛋白质模型图

3 讨论

遗传性FXI 缺陷症由Rosenthal 等[7]于1953 年首次报道，为常染色体隐形遗传性疾病，主要与合成FXI蛋白的基因发生突变有关。目前已发现了约236种与FXI 缺陷症有关的基因突变，包括错义/无义突变、剪切位点突变、调控区突变、小片段缺失突变、小片段插入缺失突变、大片段缺失突变等[8]。

本例先证者平素无明显自发性出血症状，因夏季蚊叮虫咬，皮肤破损后结痂愈合缓慢，实验室检查APTT 明显延长，FXI：C 明显减低，FⅧ：C、FⅨ：C、FXⅡ：C 无明显异常，初步诊断为FXI 缺陷症。通过先证者及家系成员基因分析发现：先证者F11 基因携带p.Gln263stop 和IVSJ-4del gttg 复合杂合突变；其母亲、二哥和侄子携带p.Gln263stop 杂合突变，其二姐、外甥女和儿子携带IVSJ-4del gttg杂合突变；p.Gln263stop 和IVSJ-4del gttg 复合杂合突变（先证者）引起FXI：C 明显下降，而单独存在p.Gln263stop或IVSJ-4del gttg 单杂合突变引起其FXI：C 水平稍低于正常对照水平。从本家系分析推测，先证者F11基因p.Gln263stop 和IVSJ-4del gttg 复合杂合突变分别遗传自其母亲和父亲，该复合杂合突变与其FXI：C 水平明显下降有关。

检索F11基因库发现，p.Gln263stop 和IVSJ-4del gttg 均已有报导[9-11]。笔者通过对F11 的p.Gln263 不同物种间的多重序列比对，发现其具有高度保守性；其c.841C ＞T 杂合无义突变，使编码263 位的谷氨酰胺提前出现终止密码子（CAA-TAA），多肽链截短使AP3 缺失部分序列，整个AP4 区域和轻链区也全部缺失，结构域的不完整和截短蛋白的不稳定，可能导致FXI：C 水平的下降。多个研究亦显示，p.Gln263stop 可能为中国人群中遗传性FXI 缺陷症的突变热点[12-13]。谢爽等[9]发现，IVSJ-4del gttg 突变可能导致内含子10 不能被正常剪切，使转录产生的mRNA因含有内含子10 的序列而出现终止密码；或者转录过程中利用隐匿剪切位点剪切，导致转录提前终止；或者外显子11 在剪切过程中被切除，外显子10 和外显子12 直接连接，所翻译的蛋白质高度不稳定而被迅速降解，从而影响FXI的合成和分泌。翁妙珊等[12]对7 例FXI 缺陷症患者的研究发现，其中4 例复合杂合突变或纯合突变患者均存在临床出血症状。因此，笔者推断本例先证者皮肤破损、结痂难以愈合的症状可能与p.Gln263stop 协同IVSJ-4del gttg 复合杂合突变有关。

综上所述，FXI 缺陷症家系FXI 水平降低可能与p. Gln263stop 杂合无义突变和IVSJ-4del gttg 剪切位点突变有关，其具体的致病机制有待体外表达试验进一步验证。

利益冲突 所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明 郭跃丽、郑温洁莹、雷晓芳：实验操作、论文撰写；孔万仲、奚经巧：数据整理、统计学分析；王明山：研究指导、论文修改、经费支持