慢性粒-单核细胞白血病与骨髓增生异常综合征的遗传学差异分析

吴越，陈莹，石淙，邹多兵，王怡，牧启田

慢性粒单核细胞白血病（CMML）是一种临床少见的造血系统克隆性疾病，发病率为（3 ～4）/10 万，主要表现为骨髓中的一系或多系病态改变，外周血单细胞持续增多（＞1×109/L）。既往，CMML 被认为是骨髓增生异常综合征（MDS）的一个亚型，但鉴于其兼有骨髓发育异常和骨髓增殖的特点，2001 年WHO造血和淋巴细胞肿瘤分类将CMML归属于骨髓增生异常/骨髓增殖性疾病（MDS/MPN）[1-2]。Geyer等[3]提出寡单核细胞CMML 特殊亚型，从而更好地区分早期“增生不良”的CMML 和骨MDS。近年来随着二代测序技术等高通量技术的发展，发现CMML和MDS 患者存在高频突变。这些突变涵盖了多种基因控制通路，其中包括表观遗传改变、剪接体复合通路依据转录因子和信号调节异常。但是关于CMML与MDS遗传学异常，尤其是基因突变差异分析的研究国内罕见报道。本文回顾性分析32 例CMML 患者和159 例MDS 患者的临床资料，比较CMML 与MDS 染色体核型和基因突变特征，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2012 年1 月至2021 年9 月在宁波市第一医院就诊且完成染色体核型或基因突变检查的CMML 或MDS 患者（CMML 32 例，MDS 159 例）的临床和实验室资料，并参照WHO（2016）标准进行诊断分型。本研究通过宁波市第一医院医学伦理委员会审查批准（2022RS021）。

1.2 染色体核型检查 抽取骨髓，接种于含20%小牛血清1 640 培养基中，37 ℃培养16 ～24 h，加入秋水仙酰胺，使细胞阻滞在分裂中期，经低渗、预固定、3 次固定等步骤制备染色体悬液。将细胞悬液在玻片上过火滴片，R 显带后，用吉姆萨液染色。显微镜分析10 ～20 个分裂中期细胞及染色体核型。依据《人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN）2020》进行核型描述。

1.3 二代测序检测基因突变 提取CMML、MDS患者骨髓细胞，抽提基因组DNA，采用Ampliseq 多重PCR 扩增并构建样本文库，在Ion proton 平台上进行高通量测序，测序后参考COSMIC 数据库进行生物信息学分析，确定致病性基因突变位点，测序深度为2 000×。检测由武汉康圣达医学检验所完成。检测位点包括NRAS、DNMT3A、SF3B1、IDH1、TET2、EZH2、JAK2、CBL、ETV6、IDH2、TP53、SRSF2、ASXL1、RUNX1 共14 种常见MDS 相关基因突变位点。

1.4 统计方法 数据使用SPSS 21.0 统计软件进行分析。计量资料比较采用Mann-Whitney U 检验，计数资料比较采用2检验或Fisher 确切概率法。P ＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CMML 与MDS 一般临床实验室指标比较CMML 患者中寡单核 CMML 7 例（21.88%），CMML-0 6 例（20.69%），CMML-1 13 例（44.83%），CMML-2 6 例（18.75%）；按照M.D.安德森预后积分（MDAPS）进行预后分层，其中低危6 例（18.75%），中危（中危1+2）24 例（75%），高危2 例（6.25%）。MDS 患者按照IPSS-r 划分：低危（极低危+低位）36例（26.64%），中危49 例（30.82%），高危（极高危+高危）56 例（35.22%），因统计资料不完整无法分层18例（11.32%）。

与MDS 患者相比，CMML 患者的男性、血小板计数、白细胞计数、中性粒细胞计数、单核细胞计数、骨髓原始细胞比例、乳酸脱氢酶和2 微球蛋白更高（均P＜0.05）；两组年龄、血红蛋白及血清铁蛋白水平等差异均无统计学意义（均P ＞0.05），见表1。

表1 CMML 与MDS 临床实验室指标特征比较

2.2 CMML 与MDS 染色体核型差异分析 在32例CMML 患者中，有30 例进行染色体核型检测，8例（8/30，26.67%）为异常核型，见表2；MDS 患者有155 例行染色体核型检测，其中80 例为异常核型（80/155，51.61%），CMML患者发现异常核型率低于MDS 患者（2=7.450，＜0.05），其中+8、+Mar 和－7/del(7q)是MDS 的常见异常核型，见图1。

图1 CMML 和MDS 异常核型的构成

表2 8 例CMML 染色体异常核型

2.3 CMML 与MDS 基因突变分析 CMML 患者中有21 例行基因突变检测，其中18 例至少有一种基因突变（18/21，85.71%）：MDS 患者有75 例行基因突变检测，有45 例至少有一种基因突变（45/75，60.0%），CMML 发生基因突变率远高于MDS（2=4.809＜0.05）。

CMML 伴有基因突变患者中，仅1 种基因突变6例（6/18，33.33%），同时有2种基因突变7例（7/18，38.88%），3 种基因突变2 例（2/18，11.1%），4 种基因突变3 例（3/18，16.67%）。常见的基因突变依次为ASXL1（6/18，33.33%）、TET2（6/18，33.33%）、NRAS（5/18，27.78%）、SF3B1（4/18，22.22%）、RUNX1（3/18，16.67%）。MDS 中仅1 种基因突变23 例（23/45，51.11%），有2 种基因突变11 例（11/45，24.44%），同时有3 种基因突变5 例（5/45，11.11%），有4 种基因突变1 例（1/45，2.22%），同时超过4 种基因突变的有5 例（5/45，11.11%）。常见的基因突变依次为AXSL1（18/45，40.00%）、TP53（17/45，33.78%）、RUNX1（15/45，33.33%）、EZH2（13/45，28.89%）、SF3B1（13/45，28.89%），见图2。

图2 CMML 和MDS14 种基因突变的分布

进一步将14 种基因突按照功能分类：表观遗传学调控因子（包括AXSL1、EZH2、TET2、DNMT3A、IDH1/2）、信号转导因子（CBL、JAK2 和NRAS）、pre-RNA 剪接因子（SF3B1 和SRSF2）、DNA 损伤因子（TP53）和基因转录因子（RUNX1、ETV6）。分析结果发现，CMML 表观遗传学调控基因突变率和信号通路调控的基因突变率均高于MDS（均＜0.05），而其他类型差异均无统计学意义，见表3。

表3 CMML 与MDS 基因功能的基因突变率比较 例（%）

3 讨论

在本研究中，与MDS 患者相比，CMML 患者白细胞计数更高，粒细胞及单核细胞增多，骨髓原始细胞比例更高，且伴有更高的血小板（均P ＜0.05）。这反映了CMML骨髓增殖特性，进而导致血小板进一步增加。同时笔者观察到CMML 患者相较MDS患者具有较高的乳酸脱氢酶和2 微球蛋白（均P ＜0.05），这也反映了CMML 由于细胞增殖呈现高代谢状态，与Germing 等[4]研究结果较为一致。

本研究CMML患者染色体异常检出率为26.67%，与国外文献报道20%～30%[5]结果较为一致。CMML总体染色体异常率明显低于MDS（P ＜0.05）。CMML 常见染色体异常类似于MDS，以+8、－Y、－7/7q－、20q－等为主[6-7]，但孤立性5q－要明显低于MDS[8]。本研究尽管CMML病例数较少，但+8 有3 例。

国外文献报道接近90%的CMML 患者可能出现分子学异常[9]。本研究中CMML 患者基因突变率为85.7%。在波兰的一项研究中，检测42 种基因突变，发现100%CMML患者存在至少1 个基因突变，而74% MDS 患者存在至少1 个基因突变[10]。在单个基因突变中，NRAS 基因突变率也明显高于MDS（P ＜0.05）。Han 等[11]研究发现，NRAS 突变在CMML中出现的概率约为36.17%，本研究NRAS基因突变出现的频率为23.81%，低于上述报道，这可能与本队列中含有7 例寡单核细胞CMML 患者有关。Carr 等[12]研究证实NRAS 突变能通过KMT2APLK1 轴持续促进细胞增殖，这可能是CMML 白细胞计数高于MDS原因之一。本研究结果显示CMML患者CBL基因突变概率高于MDS患者（P＜0.05），这与Schnittger 等[13]研究发现，CBL 突变在CMML中发生的概率约为10%，远高于MDS 的CBL 突变（小于5%）。研究显示，CBL 突变与白细胞计数呈正相关，是CMML去甲基化治疗独立预后的不良因素。新近一项研究发现，CBL 突变与LYN 激活能促进CBL 自身磷酸化，激活PI3K/AKT 信号，从而促进CMML 肿瘤细胞持续增值。本研究进一步把基因按照功能进行分类，发现CMML参与表观遗传学调控和信号通路调控的基因突变的频率高于MDS（均P ＜0.05），这提示两种疾病分子发病机制存在差异。

总之，与MDS 相比，CMML 具有高代谢性，更低染色体异常率，更高基因突变率。本研究还存在许多不足，如样本量不大，检测基因突变种类不多，还需要进一步扩大样量、增加基因突变种类进行多中心研究来验证。

利益冲突 所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明 吴越：采集数据、分析数据、统计分析、撰写论文；陈莹：数据采集、分析数据；石淙、邹多兵：采集数据；王怡：研究指导、行政、技术支持；牧启田：研究指导、论文修改、经费支持