CHI3L1 通过上调Wnt4 表达引起大肠癌细胞辐射抵抗的机制研究

金铭，叶爽，郑真，刘开泰

大肠癌（CRC）包括结肠癌和直肠癌，是常见的消化道恶性肿瘤[1]。放射治疗虽然是CRC 特别是直肠癌的重要治疗手段，但仍有相当一部分直肠癌患者对放射治疗不敏感[2-3]。研究发现，不到1/5 的局部晚期直肠癌患者在标准新辅助放化疗后可以获得病理完全缓解[4]。壳多糖酶3 样蛋白1（CHI3L1）最初发现于人骨肉瘤细胞系MG63 中[5]，在细胞增殖和抗凋亡作用中发挥着重要作用[6]，并且被进一步鉴定为促癌因子，可以促进多种癌细胞的侵袭和转移[7-8]。研究表明，CHI3L1 在CRC细胞和组织中呈高表达，且是影响CRC患者预后的独立危险因素[9]。此外，CHI3L1还可以影响CRC 细胞对靶向药物西妥昔单抗的敏感性[10]。近来研究表明，CHI3L1 过表达与肿瘤细胞的辐射抵抗密切相关，特别是在胶质瘤和乳腺癌中[11-12]。然而CHI3L1 在CRC 辐射抵抗中的作用和调控机制尚不明确，本研究拟进一步探讨CHI3L1 在CRC 细胞辐射抵抗中的作用及其潜在分子机制，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床数据 从TheCancerGenomeAtlas（TCGA）数据库下载获得380 例CRC 患者的CHI3L1 mRNA表达数据，包括380 例CRC 组织样本和51 例癌旁组织样本，其中 31 例为配对组织样本（https://xena.ucsc.edu）。此外，保存于宁波大学实验室的40 例配对CRC 及其癌旁组织样本亦用于本研究，由宁波市医疗中心李惠利医院医学伦理委员会批准。

1.2 免疫组化分析 将40 例配对CRC 组织样本进行免疫组化分析，采用组织化学评分半定量测量CRC组织样本和癌旁组织样本中CHI3L1蛋白的表达水平。H-SCORE=∑（PI×I）=（弱强度细胞百分比×1）+（中等强度细胞百分比×2）+（强强度细胞百分比×3）[12]。

1.3 细胞培养 本研究主要使用人结直肠癌细胞系SW620 和HCT116。将细胞置于37℃含5%CO2的恒温环境中，使用DMEM 培养基培养，培养基中均含有10% 胎牛血清、青霉素（100 U/ml）和链霉素（100 U/ml）。根据细胞生长速度及状态，按1∶3 的比例每2 ～3 天传代培养1 次。

1.4 CHI3L1 过表达质粒的构建和转染 在前期研究中，笔者成功构建了CHI3L1 过表达重组质粒，并将其储存在宁波大学实验室。本研究所用的质粒转染方法同前[10]。

1.5 siRNA 和转染 根据Lipofectamine 3000 说明书，对未经辐照的CRC 细胞系SW620-pCDH、SW620-CHI3L1、HCT116-pCDH 和HCT116-CHI3L1进行siNC 或siWnt4 转染。

1.6 辐照设备及参数 辐照设备：SiementsPrimus.H直线加速器；辐照参数：6 MV X线，源皮距为100 cm，剂量率为200 Gy/min，根据实验需要调整照射野大小及准直器角度。

1.7 菌落形成试验 通过克隆形成实验检测不同剂量辐射后CRC 细胞克隆形成能力。将1.2%的琼脂糖与2×DMEM按体积比1∶1 混合，制备0.6%的底层琼脂糖，按每孔1.4 ml 铺在六孔板上，让其凝固。将细胞密度调整为10 000 个/ml。将0.6%琼脂糖与2×DMEM按1∶1 比例混合，得到0.3%的上层琼脂糖，并将1 ml 上层琼脂糖与500l 细胞悬液混合，加入六孔板，每孔细胞密度为5 000 个/孔，静置凝固。将六孔板置于37 ℃、5% CO2环境中培养2 ～3 周。最后，对图像进行采集和分析。

1.8 细胞免疫荧光 采用DAPI染色评价不同剂量辐射后CRC 细胞的核破坏情况。按5 000 个/孔的细胞密度接种在六孔板中培养。弃用培养液后，加入1 ml 4%多聚甲醛，室温固定20 min。室温下，将细胞暴露于浓度为1g/ml 的DAPI 工作溶液中10 min。最后，用荧光显微镜采集图像。

运用EdU 染色评估辐射后CRC 细胞增殖情况，根据EdU-488 细胞增殖试验试剂盒说明书进行操作。加入浓度为10mol/L 的EdU 工作液，37 ℃孵育2 h。然后加入0.5%TritonX-100 孵育10min，再在黑暗中加入0.5ml Click反应孵育30min。最后，通过荧光显微镜捕获图像。

1.9 流式细胞检测 将细胞以5×105个/孔的密度接种在六孔板上，根据Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒进行操作，检测细胞凋亡情况。流式细胞仪用于区分凋亡细胞（Annexin-V 阳性）和坏死细胞（Annexin-V 阴性和PI 阳性）。细胞周期检测也同样应用流式细胞仪。

1.10 Real-time PCR 总RNA用TRIzol试剂提取，并反转录为cDNA。Wnt4 引物序列：Wnt4-F：5’-CGGAACCTGGAAGTCATG-3’，Wnt4-R：5’-CGAAGAGATGGCGTACAC-3’。根据SYBRGreen 说明书，设置反应体系为SYBRGreen 主混合液10l、上下游引物各0.4l、模板cDNA2l，然后加去离子水补充至20l。PCR反应条件：95℃加热30s，95℃变性10s，58℃退火30s，72 ℃延伸30 s；反应持续40 个循环。每个样品使用3个重复孔。用2－ Ct方法计算Wnt4 的相对表达量。

1.11 蛋白质印迹实验 应用SDS裂解缓冲液洗涤和裂解SW620 和HCT116 细胞株，提取总蛋白。使用BCA 蛋白测定试剂盒检测确定蛋白浓度。然后将蛋白与上样缓冲液混合，添加到每个通道进行电泳。接着进行转膜，设定240 mA 恒定电流转膜2 h。然后固定蛋白，并分别与抗CHI3L1 抗体和抗wnt2/4抗体在4 ℃下孵育一夜。然后，用TBST 冲洗3 次后与二抗混合孵育1 h。最后，显像及保存数据。

1.12 统计方法 数据采用SPSS 22.0 和Graphpad prism 8.0 软件分析，计量数据采用均数±标准差表示，采用 检验。＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CHI3L1 在CRC 组织和癌旁组织中的表达TCGA数据库分析显示，与51 例癌旁组织相比，380例CRC 组织中CHI3L1 mRNA 显著过表达（＜0.05），见图1a。31 例配对样本的分析也显示了同样的结果（＜0.05），见图1b。此外，40 例CRC 组织与癌旁组织的免疫组化结果显示，CHI3L1 在CRC组织及癌旁组织的表达情况差异无统计学意义（＞0.05），见图1c。

图1 CHI3L1 在CRC 组织和癌旁组织中的表达

2.2 CHI3L1 过表达与辐射后CRC 细胞克隆形成比例 通过克隆形成实验来检测CRC 细胞中CHI3L1 表达与辐射抵抗之间的相关性，分别以SW620 和HCT116 在0 Gy 条件下克隆形成数量为基准，结果显示，随辐射剂量增加（0、2、4、6及8 Gy），细胞克隆形成比例减少，CHI3L1 过表达细胞组在辐射后的细胞克隆形成比例显著多于野生细胞组（＜0.05），见图2a ～b。

图2 CHI3L1 过表达与辐射后CRC 细胞克隆形成比例比较

2.3 CHI3L1 过表达与辐射后CRC细胞坏死数量随辐射剂量增加，CRC 细胞核破坏量比例增加，CHI3L1 过表达组的细胞核破坏比例低于对照组，见图3a ～b。不同剂量辐射后，CRC 细胞坏死率增加，CHI3L1过表达组的细胞坏死率明显低于野生细胞组，见图4a～b。

图3 相对野生细胞组，不同剂量辐射后，SW620（a）、HCT116（b）细胞株中CHI3L1 过表达组细胞的细胞核破坏减少，红圈所指为破坏的细胞核

图4 相对野生细胞组，不同剂量辐射后，SW620（a ～b）、HCT116（c ～d）细胞株中CHI3L1 过表达组细胞的坏死比例减少

2.4 CHI3L1 过表达可减少辐射引起的CRC 细胞增殖抑制和G2/M 期阻滞 随辐射剂量增加，CRC细胞增殖比例降低，而CHI3L1 过表达组的细胞增殖比例明显高于野生细胞组，见图5a ～b。辐射可导致CRC 细胞G2/M 期阻滞，CHI3L1 过表达组细胞G2/M 期比例低于野生细胞组，见图6a ～b。

图5 相对野生细胞组，不同剂量辐射后，SW620（a）、HCT116（b）细胞株中CHI3L1 过表达组细胞的增殖期比例增多

图6 辐射引起大肠癌细胞G2/M 期阻滞。相对野生细胞组，不同剂量辐射后，SW620（a ～b）、HCT116（c ～d）细胞株中CHI3L1 过表达组细胞的G2/M 期阻滞比例减少

2.5 CHI3L1 通过上调Wnt4 表达导致CRC 细胞辐射抵抗 CHI3L1 过表达伴随着Wnt4 蛋白表达的上调，而Wnt2 的表达情况没有显著改变，见图7a。辐射可诱导CHI3L1 和Wnt4 蛋白的表达上调，且CHI3L1 过表达细胞组的CHI3L1 和Wnt4 蛋白表达水平上升幅度较非过表达组增加更明显，见图7b。将siNC 或siWnt4 转染到CHI3L1 过表达组的细胞中并进行敲除效率验证，见图8a～b；再次应用克隆形成实验检测辐射后CRC细胞克隆形成能力，显示经4 Gy 辐射后，Wnt4 敲除组的克隆形成比例显著低于未敲除组（P ＜0.05），见图8c。

图7 CHI3L1 表达增加伴随着Wnt4 表达水平的上调

图8 经4 Gy 辐射后，Wnt4 沉默组CRC 细胞的克隆形成比例较对照组明显下降

3 讨论

放射治疗是局部晚期直肠癌综合治疗的重要组成部分，然而辐射抵抗逐渐成为疗效影响因素之一[2-3]。笔者之前研究表明，CHI3L1 在CRC 细胞和组织中呈高表达，并且与不良预后相关；CHI3L1 过表达可以促进CRC 细胞增殖，影响CRC 细胞对西妥昔单抗的敏感性[10]。另有研究表明，CHI3L1 过表达的直肠癌患者在新辅助放化疗后肿瘤缓解率较低[13]。笔者认为CHI3L1 过表达可能参与了CRC 细胞的辐射抵抗，在本研究中通过TCGA 数据库分析发现CHI3L1 mRNA 在CRC 组织中呈高表达。但免疫组化分析结果显示，40 例配对组织样本中CHI3L1 表达在CRC 组织中有增高的趋势，但差异无统计学意义（＞0.05），这与笔者之前研究的结果不一致[10]。认为有以下3 个原因：（1）笔者前期研究样本量只有15 例，需要继续扩大样本量进一步证实。（2）前期研究中免疫组化实验采用的不是组织化学评分半定量测量法，可能存在实验者主观判读的误差。（3）CHI3L1 是一个分泌性的蛋白，癌细胞可能将其分泌到癌旁组织或外周循环中进一步发挥作用，影响了癌旁组织的免疫组化染色结果。一项肝细胞癌中的研究表明，虽然CHI3L1 在HCC 组织和癌旁组织中的表达无明显差异，但癌旁组织中CHI3L1 过表达与肝细胞癌患者的不良预后密切相关；此外，血清CHI3L1 表达水平的高低也是影响肝细胞癌诊断和预后的重要因子[14]。

本研究进一步揭示了CHI3L1 表达与CRC细胞辐射抵抗的关系。结果显示，CHI3L1 过表达的CRC细胞在不同剂量的辐射后，细胞克隆形成比例明显高于对照组，这表明CHI3L1 过表达可以促进CRC细胞的辐射抵抗。随着辐射剂量的增加，进一步发现CRC 细胞的核破坏比例增加，且CHI3L1 过表达组的CRC 细胞核损伤比例低于对照组。此外，细胞周期实验显示，随着辐射剂量的增加，CHI3L1 过表达组的细胞坏死比例更高。由此可见，CHI3L1 可以通过减少辐射诱导的细胞坏死从而导致CRC 细胞的辐射抵抗。

本研究发现，不同剂量的辐射后，CHI3L1 过表达组的CRC细胞中，增殖期细胞比例减少低于对照组；细胞周期实验提示辐射可以使CRC细胞滞留在G2/M 期，且CHI3L1 过表达组中G2/M 期细胞占比较对照组减少，G0/G1 期细胞占比增加，这进一步说明CHI3L1 可以通过减弱辐射对CRC 细胞的增殖抑制和G2/M 期阻滞，从而导致辐射抵抗。

有研究表明，激活Wnt 信号通路可以促进细胞侵袭以及诱导辐射抵抗[15-16]。本研究发现，CHI3L1过表达可以引起Wnt4 表达明显上调，不同剂量辐射后，CHI3L1 表达升高伴随着Wnt4 明显上调，且在CHI3L1 过表达组中，Wnt4 的表达增加更为显著。进一步进行回复实验后发现，Wnt4敲低组的细胞克隆形成比例减少高于未敲除组，提示Wnt4 确实参与了CRC 细胞的抗辐抵抗，并且受CHI3L1 表达的调控。

综上所述，CHI3L1 在CRC 组织中呈高表达，并参与CRC 细胞的辐射抵抗。CHI3L1 过表达可以减少辐射引起的CRC细胞坏死，减弱辐射导致的增殖抑制和G2/M期细胞阻滞；同时CHI3L1 通过上调Wnt4 表达促进CRC 细胞的辐射抵抗。

利益冲突 所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明 金铭：实验操作、论文撰写、论文修改、数据整理、统计学分析；叶爽：数据整理；郑真：统计学分析；刘开泰：实验操作、论文撰写、论文修改、数据整理、统计学分析、研究指导、经费支持