?7 烟碱型乙酰胆碱受体调控线粒体自噬在脓毒症急性胃肠损伤中的作用机制研究

费丽萍，陈志冬，陈金锦，朱冰楠，唐坎凯

全球每年新增脓毒症患者人数达数千万，且病死人数至少1/6[1]。脓毒症常累及身体脏器损伤，引起多器官功能异常，患者病死风险较高。肠道为最先累及脏器，亦为最有可能诱发脓毒症的窗口。脓毒症急性胃肠损伤（AGI）可导致机体营养不良、菌群失调及免疫功能紊乱，引起肠源性感染，进一步引发或者加剧其他脏器的功能异常，导致患者预后不良。以往报道称，7 烟碱型乙酰胆碱受体（ 7nAChRs）水平变化与脓毒症患者炎症控制及预后密切相关[2]。 7nAChRs 激动剂可以降低促炎因子合成水平，提高脓毒症患者生存率。线粒体自噬受到抑制时，能够使线粒体去极化，促进NLRP3 炎症小体激活，提高活性氧物质（ROS）、白介素1（IL-1 ）、IL-18水平，加剧促炎反应[3]。当前，鲜少有关于7nAChRs调控线粒体自噬的报道，本研究探究7nAChRs 调控线粒体自噬在脓毒症AGI中的作用及机制，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器与试剂 2 500 倍电子显微镜，培养箱（厂家：美国thermo 公司），酶联免疫吸附试剂盒（购自上海恒远生物科技有限公司），胎牛血清及胰蛋白酶（由美国GIBCO 公司提供），Dneasy Blood&Tissue Kit 试剂盒（购自美国sigma-aldrich），SYBR Green MIX试剂盒（购自德泰生物），RIPA裂解液（购自北京百奥莱博科技有限公司），bca试剂盒（购自鼎国生物技术有限公司），羊抗兔二抗、P62 一抗以及parkin 一抗（购自Santa Cruz 公司）。

1.1.2 动物与细胞 30 只清洁级大鼠，均为雄鼠，重量约200 g，6 月龄，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（京）2018-0022。RAW264.7 细胞由中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心提供。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分组及模型建立 将大鼠随机分为脓毒症AGI 大鼠模型组（模型组）、模型+迷走切除组、假手术组（Sham 组），每组10 只。模型组：通过盲肠结扎穿孔（CLP）法构建脓毒症AGI大鼠模型；Sham组不做CLP，其他操作同模型组；模型+迷走切除组：开腹后将脓毒症AGI 模型大鼠的迷走神经前支及后支切断，用有齿眼科镊对腹腔动脉、肠系膜动脉与腹主动脉间分布的交感神经节进行钝性分离并做去除处理。术后6 h 取大鼠肠组织，制作超薄切片，进行脱水处理，采取醋酸铀酰及柠檬酸染色，然后于电子显微镜下仔细观察线粒体自噬空泡变化。于术后6 h取大鼠肠道组织，将其剪碎后制作成为组织匀浆液，使用酶联免疫吸附法进行IL-1 、IL-6、肿瘤坏死因子（TNF- ）的测定，严格按照试剂盒说明书操作。

1.2.2 细胞培养及转染 将细胞放入含10%胎牛血清的改良Eagle 培养基（DMEM）中，置于细胞培养箱（湿度恒定，温度37 ℃以及5%CO2）进行常规培养，等细胞汇合度为70%～80%时开始传代，采取含0.2%乙二胺四乙酸（EDTA）胰蛋白酶进行传代消化，取对数期细胞完成后续试验。在6 孔板上接种细胞，待其汇合度增至50%开始转染。 7nAChRs siRNA组（n=3）：转染siRNA- 7nAChRs 质粒；阴性对照组（n=3）：转染siCtrl 序列，两组3 个复孔，置于培养箱培养24 h。

1.2.3 mtDNA相对表达量检测 收集细胞沉淀，加入Tricine-NaOH 缓冲液后采用玻璃匀浆器行匀浆处理；粗提线粒体DNA（mtDNA），接着用Dneasy Blood&Tissue Kit 试剂盒纯化；使用实时荧光定量PCR（qPCR）检测mtDNA，选择SYBR Green MIX 试剂盒，以mtDNA编码形成细胞色素c氧化酶I（COI）反映mtDNA，内参选择核DNA 编码的相应18S rRNA，引物序列见表1。利用公式计算mtDNA 相对表达量。

表1 引物序列

1.2.4 P62、parkin 表达量检测 收集培养的细胞，加入RIPA 裂解液予以裂解处理，然后提取总蛋白，采取bca 试剂盒完成蛋白测定。进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，并在恒流转膜后，在其中加入P62 一抗、parkin 一抗，控制为1 ∶1 000，将其封闭过夜，并于室温孵育2 h 后加入tris-hcl 缓冲液进行洗膜，然后继续加入羊抗兔二抗（控制为1 ∶6 000），于室温放置1 h，接着磷酸缓冲盐溶液洗膜，予以化学曝光显影处理，冲洗胶片，通过Gel-Pro_analyzer4.0 获得灰度值，其中目的蛋白表达量为其灰度值与-actin灰度值的比值，重复3 次取平均值。

1.3 统计方法 使用SPSS 20.0 统计软件进行处理，正态分布计量资料以均数±标准差表示，组间使用独立样本t 检验，多组采取单因素方差分析。P ＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 电镜观察 Sham组细胞内线粒体较小；模型组细胞内线粒体变大，嵴变短变少；模型+迷走切除组线粒体转化为空泡状，见封三彩图2。

图2 电子显微镜下线粒体自噬空泡（醋酸铀酰及柠檬酸染色，×2 500）

2.2 3 组IL-1 、IL-6、TNF- 比较 模型+迷走切除组、模型组IL-1 、IL-6、TNF- 水平高于Sham 组（均P ＜0.05），模型+迷走切除组高于模型组（均P ＜0.05），见表2。

表2 3 组IL-1 、IL-6、TNF- 比较

2.3 7nAChRs siRNA 组与阴性对照组mtDNA 比较 7nAChRs siRNA 组mtDNA 相对表达量高于阴性对照组（P ＜0.05），见表3。

表3 7nAChRs siRNA 组与阴性对照组mtDNA 比较

2.4 7nAChRs siRNA 组与阴性对照组P62、parkin表达量比较 7nAChRs siRNA 组P62、parkin 水平均低于阴性对照组（均P ＜0.05），见表4。

表4 7nAChRs siRNA 组与阴性对照组P62、parkin 表达量比较

3 讨论

7nAChRs主要表达于机体免疫细胞，发挥着抗炎作用。线粒体通过自噬方式进行自身质量控制，如果自噬受阻，将导致促炎反应加剧[4]。本研究通过迷走切除术使7nAChRs失活，发现模型组细胞内线粒体变大，嵴变短变少；模型+迷走切除组线粒体则转化为空泡状。这表明7nAChRs 失活可导致线粒体自噬减少。活化状态7nAChR可对microRNA-124形成起到诱导作用，干扰信号转导和转录激活因子3（STAT3）mRNA 翻译过程，降低IL-6 水平[5]。同时，microRNA-124 亦能抑制TNF- 转换酶（TACE）基因翻译，降低TNF- 表达水平[6]。TNF- 作为主要促炎因子，于胃肠炎性疾病产生机制中发挥着重要调节作用，能够刺激内皮细胞分泌IL-1 等物质[7]。IL-1可以通过自分泌及旁分泌刺激相关细胞因子、各种炎症介质合成，提高补体、吞噬细胞与NK细胞活性，加剧细胞免疫及体液免疫，最终诱发肠道炎性反应。沈越等[8]研究指出，激动7nAChRs 能够对炎症反应产生抑制作用。本研究模型+迷走切除组与模型组大鼠肠组织IL-1 、IL-6、TNF- 水平高于Sham 组，且模型+迷走切除组高于模型组，这说明7nAChRs失活可加剧脓毒症AGI 肠组织炎症反应，导致胃肠损伤加重。在巨噬细胞里面，7nAChRs 不仅能够阻止核因子B（NF- B）激活，同时又能促进蛋白酪氨酸激酶2（JAK2）-STAT3 激活，以此反向调控NF- B结合相应靶向DNA，降低相关炎症因子水平[9]。

7nAChRs 于心肌[10]、炎症性肠病[11]中被证明了能够增加细胞自噬能力。 7nAChRs 能够通过降低巨噬细胞之中mtDNA释放水平，对炎症小体NLRP3产生抑制作用，进而减少IL-1 及高迁移率族蛋白B1（HMGB1）合成与表达。本研究发现，通过下调巨噬细胞7nAChRs 的表达，mtDNA 相对表达量明显升高，7nAChRs 能够减少线粒体DNA 释放。Parkin属于线粒体自噬的一种标志性蛋白，一旦线粒体受损，parkin将会识别受损线粒体表面E3 泛素连接酶，同时P62 能够诱导parkin 大量聚集，并对细胞器自噬清除产生促进作用。以往研究指出，在受损线粒体清除过程中，P62 为重要介质，可影响线粒体自噬快慢[12]。本研究发现，沉默巨噬细胞7nAChRs 基因能够降低P62、parkin 表达水平，从而减少线粒体自噬。

综上，7nAChRs 的失活能够阻止线粒体自噬，使得脓毒症AGI 患者肠道组织炎症加重，其可能通过下调巨噬细胞P62、parkin等表达，提高mtDNA水平机制实现。

利益冲突 所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明 费丽萍：实验操作、采集数据、分析数据、起草撰写文章；陈志冬：获取研究经费、设计及实施实验；陈金锦：实施研究、采集数据；朱冰楠：统计分析、查阅文献；唐坎凯：指导研究过程、论文修改