一株对核桃长足象具有强致病力球孢白僵菌的分离与鉴定1)

赵玉雪 朱佳敏 杨霞 吴柳燕 赵奕

(贵州省核桃研究所,贵阳,550055) (广东省林业科学研究院)

核桃长足象(AlcidodesjuglansChao)属鞘翅目(Coleoptera)象甲科(Curculionidae),是核桃树主要害虫之一,在我国的核桃产地多有分布,虫害情况十分严重,主要发生蛀果危害[1]。核桃长足象1年发生1代,成虫在果实里产卵,卵孵化后形成幼虫,其幼虫在果内蛀害时间长且隐蔽,防治困难,早期幼虫会蛀食种仁,导致落果,而后期幼虫会导致核桃青皮腐烂而污染果壳,损害其商品价值[2-5]。

根据核桃长足象的生物学特性,现有的主要防治方法有捡拾落果、打孔施药、喷施施药法等,但这些方法难以减轻虫口密度,且农残过重,抗药性也过强,无法长期使用。目前已发现的虫生真菌约有1 000余种[6],球孢白僵菌(Beauveriabassiana)作为其中之一,具有致病力强、杀虫谱广、容易培养及易飞扬扩散等特点,还具有防治植物病害和虫害的双重作用[7],其普遍应用在森林害虫和农业害虫的防治上[8]。在核桃上,杨世璋等[9]就不同昆虫上分离出的球孢白僵菌对核桃长足象成虫的致病性与防治效果做了初步的研究,研究表明,球孢白僵菌对核桃长足象具有较强的致病力。本文也通过收集核桃长足象的僵虫进行研究。首先,从收集到的僵虫上进行病原菌的分离纯化并获得菌株,通过形态鉴定及基因序列分析鉴定菌种,再以核桃长足象为供试虫源,测定菌株对核桃长足象的致病性,以确定其杀虫活性较强的孢子悬浮液浓度。

1 材料与方法

供试昆虫:核桃长足象僵虫采集于贵州省清镇市犁倭镇右八村。

供试核桃长足象成虫为采集受幼虫危害的落果,带回实验室,放入饲养盒中,以纱网封住顶部,待幼虫羽化成虫后收集成虫,以新鲜核桃果实和核桃枝条饲养备用。

分离纯化与保存:将采集回的核桃长足象僵虫浸泡在体积分数为70%的乙醇中消毒,30 s后放入质量分数为0.1%的升汞中再消毒1.5 min,用灭菌水漂洗3次,用灭菌的滤纸将核桃长足象成虫虫体上的水分吸干,放置在配制好的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基中。将培养基放入恒温培养箱中27 ℃培养2～3 d,待PDA中的核桃长足象周围长出新菌丝后,把新长的菌丝挑取到新的PDA培养基上,此操作重复3次,然后用稀释纯化法对病菌进行单菌落分离,得到复壮的、致病力强的菌株。将高毒力菌株转接到PDA斜面培养基上,放置在4 ℃条件下进行保存。

菌株形态特征:把保存的菌株重新转接到明胶培养基和PDA培养基上,并在恒温培养箱中27 ℃培养,按时观察菌落生长,记录颜色、形态。挑取PDA培养基上的菌株,配制分生孢子悬液,吸取10 μL悬液至玻片上,在尼康DS-Ri1生物数码显微镜下观察分生孢子的形态大小。采用库赛姆(COXEM)EM-30台式扫描电镜观察菌株分生孢子显微结构。

菌株分子生物学鉴定:用北京擎科生物科技有限公司的植物DNA提取试剂盒(通用型)提取菌株的基因组DNA,采用不同的引物分别扩增菌株的ITS和β-tubulin基因片段(表1)。PCR反应体系为50 μL,其中上下游引物各2 μL,1×TSE101金牌mix4为5 μL,DNA模板为1 μL。以上扩增体系按以下扩增程序扩增:98 ℃预变性2 min;98 ℃变性10 s,53 ℃退火10 s,72 ℃延伸10 s,39个循环;72 ℃,延伸5 min。将扩增好的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(2 μL样品+6 μL溴酚蓝),300 V电压下12 min,获取鉴定胶图。分子测序与菌种鉴定回收后的PCR产物由北京擎科生物科技有限公司进行。用ContigExpress软件拼接测序结果,将拼接好的序列在国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中进行比对,以相似性99%及以上为标准,进行菌种的分子鉴定。

选取序列,与NCBI数据库进行BLAST比对,并下载相关序列,用Mega 7软件分析,并采用邻接法(NJ)进行系统发育树的构建。

表1 PCR扩增引物序列

菌株的致病性测定:将分离纯化的菌株接种到PDA平板培养基上,于27 ℃恒温条件下培养10 d后,刮取其分生孢子,用血球计数板确定孢子悬浮液的菌浓度,再以无菌水稀释成菌浓度分别为108、107、106、105、104个/mL的孢子悬浮液备用。

采用浸泡法进行毒力测定试验。每个菌浓度分别挑取核桃长足象健壮成虫约30头(每次重复约10头,共3次重复),将健壮的核桃长足象浸泡在对应菌浓度的孢子悬浮液中8 s后,置于剪取的新鲜核桃枝条叶片及核桃果上培养,枝条及核桃果放置在玻璃瓶中,以纱网封顶面,培养温度为27 ℃,相对湿度80%,光照周期为12 h黑暗、12 h光照,并以体积分数0.1%的吐温-80作为对照。每天定时检查成虫的侵染情况,及时更换新鲜核桃枝条,以虫体长出白色菌丝,最后被菌丝包围,产生分生孢子层为死亡标准,记录死亡数量。

累计死亡率=(死亡数/处理总数量)×100%;

校正死亡率=[(处理组死亡率-对照组死亡率)/(1-对照组死亡率)]×100%[10]。

数据处理:用EXCEL软件计算各处理的累计死亡率、校正死亡率;用SPSS软件计算各处理的半致死时间(LT50)。

2 结果与分析

2.1 菌株形态特征

将分离纯化培养的菌株命名为编号QZCZX-1,并对其进行鉴定。在PDA培养基上,培养初期菌落呈白色长绒状,背面无色,在光学显微镜下观察,菌丝透明光滑,至培养后期,菌落呈淡黄色粉末状,背面呈现黄色(图1A、B)。在明胶培养基上,菌株为白色(图1C、D)。在数码显微镜下测量出孢子大小为1.1 μm×2.1 μm～1.7 μm×2.5 μm(图1E),且观察到大量孢子在泡囊表面聚集成圆球状。通过扫描电镜发现,分生孢子为单孢,透明、光滑,多呈卵圆形(图1F)。

2.2 菌株分子生物学鉴定

分别扩增菌株的ITS和β-tubulin基因片段,将测序结果进行BLAST比对,菌株QZCZX-1与球孢白僵菌(Beauveriabassiana)的同源性均为99%以上。

菌株选取的PCR引物不同,扩增片段不同,因此以邻接法进行不同序列系统发育树的构建。以ITS序列为基础构建的菌株QZCZX-1与相关菌株的系统发育树中,以长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)为外群,结果表明,菌株QZCZX-1与球孢白僵菌多株菌株及蠕孢白僵菌(Beauveriavermiconia)有亲缘关系,与球孢白僵菌是在同一分支,且菌株QZCZX-1与球孢白僵菌CCTU229菌株处于进化树最小分支,亲缘关系最近,同源性最高(图2)。以β-tubulin序列为基础构建的菌株QZCZX-1与相关菌株的系统发育树中,以刀孢轮枝菌(Lecanicilliumpsalliotae)为外群,结果表明,菌株QZCZX-1与球孢白僵菌多株菌株及苏格兰白僵菌(Beauveriacaledonica)有亲缘关系,且菌株QZCZX-1与球孢白僵菌ARSEF2860菌株处于进化树最小分支,亲缘关系最近,同源性最高(图3)。结合菌株的形态特征,可将菌株QZCZX-1确定为球孢白僵菌。

A为PDA培养基培养后期菌落正面;B为PDA培养基培养后期菌落背面;C为明胶培养基培养的菌落正面;D为明胶培养基培养的菌落背面;E为分生孢子数码显微镜下照片;F为分生孢子及分生孢子梗电镜扫描照片。

图1 菌株QZCZX-1的形态特征

2.3 菌株的致病性

通过进行菌株QZCZX-1对核桃长足象的致病力测定,发现该菌株对核桃长足象有较强的致病性。接种25 d后的试验结果表明,分生孢子悬浮液菌浓度越高,对核桃长足象的致死率越高,LT50值越小。在菌浓度为104个/mL时,核桃长足象的校正死亡率仅有51.85%,LT50却长达22.591 d;随着菌液浓度的升高,菌株QZCZX-1对核桃长足象的校正死亡率升高,LT50缩短,在菌浓度为108个/mL时,核桃长足象的校正死亡率达到最高,为92.59%,对其LT50也缩短至13.993 d(表2)。

3 结论与讨论

球孢白僵菌作为虫生真菌能侵染多种昆虫,且致病性强,不易产生抗性。本研究从林间采回核桃长足象僵虫,分离纯化得到菌株QZCZX-1,培养后,通过形态学特征观察及序列比对,鉴定其为球孢白僵菌。测定QZCZX-1对核桃长足象的致病性,由数据可知,菌液浓度为108个/mL时,核桃长足象的校正死亡率最高,为92.59%,LT50最短,仅为13.993 d。由此可见,本研究中获得的球孢白僵菌菌株对核桃长足象具有强致病性,能够为后续核桃长足象的生物防治提供菌源。

图2 以ITS序列为基础构建目的菌株与相关菌株的系统发育树(邻接法)

图3 以β-tubulin序列为基础构建目的菌株与相关菌株的系统发育树(邻接法)

表2 菌株QZCZX-1对核桃长足象成虫的毒力测定结果

致病力的高低是筛选病原真菌高效菌株的重要指标,球孢白僵菌作为昆虫病原真菌,具有寄主专一的特点,在不同寄主上其毒力也不相同,田佳等[11]通过对桃蚜的致病性测定,筛选出的菌株具有高致病性;宋晓兵等[12]从柑橘木虱虫体分离得到一株对柑橘木虱的校正死亡率高达95.7%的球孢白僵菌;陶淑霞等[13]从大豆食心虫老熟幼虫上分离出8个球孢白僵菌菌株,筛选得到对大豆食心虫侵染率达90%的高毒力菌株;在草地贪夜蛾上分离出来的球孢白僵菌,均表现出较强的致病力[14]。本研究在确定了菌株QZCZX-1为球孢白僵菌后,进行了对核桃长足象致病力的测定,通过得到的校正死亡率、LT50等数据表明,该菌株在高浓度下对核桃长足象的致死率较高。由此发现,菌株QZCZX-1对核桃长足象具有较好的生防潜力。

菌株QZCZX-1对室内核桃长足象的毒力较强,但在林间的应用效果却未知,耿显胜等[15]在分离竹卵圆蝽致病球孢白僵菌后,对其林间的致病效果有所测定,发现林间测定的累计死亡率明显低于室内毒力测定结果。因此,菌株QZCZX-1对核桃长足象的林间应用也亟需探明。筛选对昆虫具有强毒力的优良菌株是成功进行生产防治的前提[16],在完全探明菌株QZCZX-1的特性后,可将其开发成生防菌制剂,这也能促进新型生物农药的产业化进程,以减少在核桃长足象防治过程中所产生的抗药性、农药超标和环境污染等问题。