藏药肉果草中1对新的木脂素苷

王俊林，张 炜，尚宇欣，李文博，唐 璐，朱 怡，赵伟伊，苏艳芳*

•化学成分 •

藏药肉果草中1对新的木脂素苷

王俊林1，张 炜2，尚宇欣1，李文博1，唐 璐1，朱 怡1，赵伟伊1，苏艳芳1*

1. 天津大学药物科学与技术学院，天津 300072 2. 青海省药品检验检测院，青海 西宁 810016

研究肉果草的化学成分。综合应用硅胶、Sephadex LH-20和制备液相等多种色谱方法进行分离纯化，并根据化合物NMR谱、MS谱等数据进行结构鉴定。采用斑马鱼炎症模型进行抗炎活性评价。从肉果草乙醇提取物的醋酸乙酯萃取部位中分离得到1对新的四氢呋喃型木脂素苷类化合物（1a和1b）和已知化合物肉果草苷（2）。化合物1a和1b为新化合物，是1对能发生差向异构的、不可分的化合物，分别命名为肉果草苷A（1a）、肉果草苷B（1b），且具有抗炎活性。

肉果草；四氢呋喃型木脂素；肉果草苷A；肉果草苷B；抗炎

肉果草为玄参科（Scrophulariaceae）肉果草属Hook. f. et Thoms.植物肉果草的干燥全草，别名兰石草，藏文音译名为巴雅巴、哇亚巴，主要分布于印度及我国西藏、青海、四川、云等地，生于海拔2000～4500 m的草地、疏林中或沟谷旁，在藏药中被列为上品，其全草可清肺热、止咳、消脓。肉果草作为藏族民间常用药，多入丸、散剂，在上市品种二十五味肺病胶囊（丸）、回生甘露丸、二十五味竺黄散等藏成药中均有应用[1-4]。文献报道其主要化学成分为木脂素苷类、黄酮类、萜类等[5-7]。为进一步明确其物质基础，对肉果草乙醇提取物醋酸乙酯萃取部位的成分进行了研究，分离并鉴定了3个四氢呋喃型木脂素，分别为肉果草苷A [(7,8, 8′,9′)-9′-hydroxyl tibeticoside，1a] 和肉果草苷B [(7,8,8′,9′)-9′-hydroxyl tibeticoside，1b]、肉果草苷（tibeticoside，2）。其中，化合物1a和1b为1对新的木脂素苷类化合物，结构见图1；活性研究结果表明化合物1（1a和1b）具有抗炎活性。

图1 化合物1a和1b的化学结构

1 仪器与材料

Bruker Avance III核磁共振谱仪（400 MHz，瑞士Bruker公司），Nikon SMZ800N体视显微镜（日本Nikon公司），Sephadex LH-20（瑞典Amersham Pharmacia公司）；ZORBAX SB-C18HPLC制备柱（250 mm×21.2 mm，7 μm，美国Agilent公司）；ZORBAX SB-C18HPLC分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美国Agilent公司）；薄层色谱硅胶（GF254，10～40 µm）和柱色谱硅胶（100～200、200～300目，青岛海洋化工厂）。色谱甲醇（天津市康科德科技有限公司）；其他试剂均为分析纯；水为娃哈哈纯净水；转基因品系斑马鱼[（：）]，由天津大学庞美俊课题组提供），脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）试剂（美国Sigma-Aldrich公司），E3培养基（5 mmol/L NaCl、0.17 mmol/L KCl、0.33 mmol/L CaCl2、0.33 mmol/L MgSO4）。

肉果草于2021年8月采集于青海省黄南藏族自治州泽库县，经青海省药品检验检测院骆桂法主任药师鉴定为玄参科肉果草属植物肉果草Hook. f. et Thoms的全草。标本（21258201）保存于青海省药品检验检测院中藏药标本馆。

2 方法

2.1 提取与分离

肉果草（7.8 kg）用95%乙醇于室温冷浸2周，然后依次用95%、60%乙醇各加热回流提取2次，每次2 h。合并提取液，减压浓缩得到提取物2.9 kg，提取物用适量蒸馏水混悬，依次用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物（240 g）、醋酸乙酯萃取物（670 g）和正丁醇萃取物（1000 g）。取醋酸乙酯萃取物650 g，经硅胶柱色谱分离，二氯甲烷-甲醇（100∶0→98∶2→94∶6→90∶10→84∶16→74∶26）梯度洗脱，每500毫升接收1个流分，共得到163个流分，合并Frs. 107～109（23 g），经硅胶柱色谱进一步分离，二氯甲烷-甲醇（94∶6→92∶8→90∶10）梯度洗脱，得次级流分SubFrs. 1～116，合并SubFrs. 6～13（0.77 g），再经2次Sephadex LH-20柱色谱分离纯化，甲醇洗脱，得到化合物2（290 mg）；SubFr. 99（0.48 g）经Sephadex LH-20柱色谱分离纯化，甲醇洗脱，得到化合物1（80 mg）：化合物1经HPLC分析（45%甲醇-水，Zorbax SB-C18柱，检测波长254 nm）提示为2个化合物的混合物，其保留时间分别为7 min（1a）和16 min（1b），进一步经HPLC制备后发现1a和1b是一对能发生互变异构的、不可分的化合物。

2.2 酸水解实验

化合物1（1a和1b）的水解薄层色谱分析[8]：将化合物1（1a和1b）点样在硅胶TLC板上，置于装有浓盐酸的密闭容器中，室温HCl蒸气水解30分钟，取出薄层板，室温晾至无酸味，将葡萄糖标准品点样在同一硅胶TLC板上，二氯甲烷-甲醇-水- 冰醋酸（3.5∶1.5∶3滴∶3滴）展开，邻苯二甲酸苯胺显色，结果表明化合物1（1a和1b）酸水解产物中的糖为葡萄糖（R值为0.41）。

3 结构鉴定

化合物1a的氢谱中，H6.75～7.09有2组苯环氢信号，分别为[H6.87 (1H, d,= 1.3 Hz, H-2), 6.85 (1H, dd,= 8.0, 1.3 Hz, H-6), 6.75 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5)] 和[H6.93 (1H, d,= 1.3 Hz, H-2′), 6.91 (1H, dd,= 8.0, 1.3 Hz, H-6′), 6.77 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5′)]，结合12个芳香碳信号(C149.2, 149.0, 148.5, 148.1, 139.3, 139.1, 121.6, 119.9, 109.0, 108.9, 108.4, 107.3)，提示存在2个1,2,4-三取代苯环；氢谱信号H5.91, 5.91 (4H, s, H-10, 10′)，结合碳谱信号(C102.37, 102.33)，表明1a结构中有2个亚甲二氧基；氢谱信号[H4.44 (1H, t-like,= 8.9 Hz, H-9a), 4.15 (1H, dd,= 8.9, 3.9 Hz, H-9b)]，结合碳谱信号C70.8，表明1a结构中有1个氧化亚甲基；氢谱信号[H5.26 (1H, d,= 2.1 Hz, H-7), 4.69 (1H, d,= 10.1 Hz, H-7′), 4.91 (1H, d,= 4.3 Hz, H-9′)]，结合碳谱信号(C85.0, 71.5, 99.6)，表明1a结构中有3个氧化次甲基，与化合物2相比，化合物1的H-9′低场位移约H1，C-9′低场位移约C28，提示化合物2的C-9′位连接羟基；氢谱中H4.41 (1H, d,= 7.7 Hz, H-1′′）为六碳糖的端基氢信号，结合碳信号(C104.2, 78.3, 78.2, 75.3, 71.7, 62.9)，结合酸水解结果表明化合物1a为1个β--葡萄吡喃糖苷（1H-和13C-NMR数据见表1）。以上信息提示化合物1a为1个四氢呋喃型木脂素葡萄糖苷。

由1H-1H COSY谱（图2），可观察到H-7/H-8/H-9、H-7′/H-8′/H-9′以及H-8/H-8′之间存在明显相关，结合H-7 (H5.26)/C-2 (C107.3), C-6 (C119.9), C-9 (C70.8)、H-7′ (H4.69)/C-2′ (C108.4), C-6′ (C121.6), C-9′ (C99.6) 的HMBC相关，进一步确证该化合物1a母核为7--9′四氢呋喃型木脂素（图2）；H-9 (H4.44, 4.15)/C-1′′ (C104.2) 的HMBC相关，确定C-9连接葡萄糖形成氧苷，H-10, 10′ (H5.91)/C-3 (C148.1), C-4 (C149.0), C-3′ (C148.5), C-4′ (C149.2) 的HMBC相关，确定2个亚甲二氧基分别与苯环的C-3, 4和C-3′, 4′相连。

表1 化合物1a和1b的1H-NMR和13C-NMR数据(400/100 MHz CD3OD)

a, b, c, d, e 表示可分别互换

a, b, c, d, e may be interchanged in each column.

图2 化合物1a的主要1H-1H COSY和HMBC相关

在NOESY谱图中，1a的NOE相关信号（图3）：H-7 (H5.26)/H-9′ (H4.91), H-8 (H2.59)/H-9′ (H4.91), H-7′ (H4.69)/H-9 (H4.44, 4.15)，说明化合物1a的H-7，H-8，H-8′和H-9′位于四氢呋喃环同侧，同时，在ECD谱中250 nm 和300 nm处均显示负Cotton效应（图4），结合参考文献数据[9-10]推测化合物1a的绝对构型为7,8,8′,9′，鉴定为(7,8,8′,9′)-9′-hydroxyl tibeticoside。化合物1a的结构见图1，经Sci-Finder检索为新化合物，命名为肉果草苷A。

图3 化合物1a和1b的主要NOESY相关

图4 化合物1a的ECD图

化合物1b：化合物1b的氢谱和碳谱与化合物1a非常相似（表1），仔细分析1b的HSQC、COSY和HMBC谱，提示化合物1a和1b均为葡萄糖苷，且苷元的平面结构相同，进一步分析其NOESY谱（图3），化合物1b的H-7′ (H4.73)/H-9′ (H4.99) 有NOE，说明化合物1b的H-9′与H-7、H-8、H-8′处于四氢呋喃环的异侧。最后鉴定定化合物1b的结构为(7,8,8′,9′)-9′-hydroxyl tibeticoside，见图1，经Sci-Finder检索为新化合物，命名为肉果草苷B。

化合物1a和1b的C-9′位连接半缩醛羟基，易发生差向异构，不能分离纯化，是一对不可分的化合物，因此只能混合鉴定其结构[9-10]。

4 抗炎活性筛选

在体视显微镜（Nikon SMZ800N）下，随机选择受精后3 d（dpf）发育正常的斑马鱼胚胎移入24孔板中。将斑马鱼分为以下3组：空白组、模型组和实验组。对于空白组，3 dpf的胚胎继续在E3培养基中正常培养。对于模型组，将3 dpf 的胚胎暴露于LPS（10 μg/mL）4 h，构造斑马鱼的炎症模型。对于实验组，先将3 dpf的胚胎暴露于LPS（10 μg/mL）4 h，再用不同浓度（50、100和200 μmol/L）的化合物1（1a和1b）处理斑马鱼4 h，接着换为E3培养基继续培养。对4 dpf的斑马鱼进行麻醉，从每组中随机选取不少于6条进行图像采集。

a-荧光面积统计 b-荧光强度统计 与空白组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01

5 讨论

本实验从肉果草中分离鉴定了1对新的四氢呋喃型木脂素苷类化合物，分别命名为肉果草苷A和肉果草苷B，是一对不可分的差向异构体，且该化合物具有抗炎活性，为肉果草进一步研究开发提供了科学依据。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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A pair of new lignan glycosides from Tibetan medicine

WANG Jun-lin1, ZHANG Wei2, SHANG Yu-xin1, LI Wen-bo1, TANG Lu1, ZHU Yi1, ZHAO Wei-yi1, SU Yan-fang1

1. School of Pharmaceutical Science and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China 2. Qinghai Institute of Medicinal Product Inspection and Detection, Xining 810016, China

To study the chemical constituents of.The chemical constituents were isolated and purified by silica gel, Sephadex LH-20 column chromatography and preparative RP-HPLC. Their structures were elucidated by analysis of NMR and HR-ESI-MS spectroscopic data. Zebrafish model was used to evaluate the anti-inflammatory activity of compounds.A pair of new tetrahydrofuran-type lignan glycosides (1a and 1b) and a known compound (tibeticoside) were isolated from theEtOAc-soluble partition of the aqueous ethanolic extract of.Compounds 1a and 1b are new compounds, a pair of epimeric and indivisible compounds, named (7,8,8′,9′)-9′-hydroxyl tibeticoside and (7,8,8′,9′)-9′-hydroxyl tibeticoside, respectively. And compound 1 shows anti-inflammation activity.

Hook. f. et Thoms; tetrahydrofuran-type lignans; (7,8, 8′,9′)-9′-hydroxyl tibeticoside; (7,8,8′,9′)- 9′-hydroxyl tibeticoside; anti-inflammation

R284.1

A

0253 - 2670(2023)10 - 3049 - 05

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.10.001

2023-02-21

天津市科技计划项目（20ZXGBSY00050）

王俊林，女，硕士研究生，研究方向为天然药物化学。E-mail: wangjunlin_001@tju.edu.cn

苏艳芳，教授，主要从事天然药物化学研究。E-mail: suyanfang@tju.edu.cn

[责任编辑 王文倩]