尿激酶在治疗慢性创面中的作用

2023-05-10刘太阳余恩艳陈志勇余雪丰

宁夏医科大学学报 2023年3期

刘太阳，余恩艳，陈志勇，余雪丰，赵涛

（重庆大学附属涪陵医院，涪陵 408000）

由于各种原因造成的创面经过1～3 个月的正规治疗没有愈合趋势，进入病理性炎性反应状态，临床上称为慢性创面[1-2]。慢性创面具有病程长、治疗难度大、易复发、费用昂贵等特点，给患者身体和心理带来巨大痛苦[3]。因此，探索更加廉价、方便、有效的治疗方案对于慢性创面治疗有十分重要的意义。

创面局部血管受损后血栓形成，影响创面局部血液循环和营养供应。有专家提出“创面床准备”的概念[4]，旨在改善局部血液循环，增加促进创面愈合的物质[5]，改善创面的局部“微环境”，使慢性创面变为对治疗有反应的创面[6]。尿激酶是一种纤溶酶原激活剂，能直接作用于内源性纤维蛋白溶解系统，降解纤维蛋白原及纤维蛋白凝块，溶解血栓[7]。尿激酶能溶解腹腔内纤维隔、纤维蛋白以及引流管中的菌膜，治疗腹膜炎[8-9]。应用尿激酶可溶解胸腔内的纤维蛋白及纤维蛋白原，裂解纤维分隔，防止胸膜粘连，稀释胸腔积液，促进胸腔积液的吸收及引流[10]。而且，尿激酶在体外对于中心静脉导管和透析导管中的血栓或纤维条索也能发挥其纤溶作用[11]。目前，尿激酶在慢性创面中应用是否有效并示确证。因此，本研究将探讨尿激酶在慢性创面床准备中的效果以及临床应用的安全性。

1 对象与方法

1.1 研究对象

1.1.1 一般情况回顾性分析2019 年6 月至2021 年4 月重庆大学附属涪陵医院烧伤整形科诊断的慢性创面的52 例患者。其中生理盐水组27 例，女性9 例，男性18 例；尿激酶组25 例，女性8 例，男性17 例。年龄23～80 岁，创面面积23～56 cm2。本研究经过重庆大学附属涪陵医院伦理委员会批准（2019CQSFLZXYYEC-019）。

1.1.2 纳入标准 1）20 岁≤年龄≤80 岁，男女不限；2）符合慢性创面诊断标准；3）创面面积23～56 cm2；4）无HIV 感染；5）凝血功能正常、外周血细胞和血小板无明显减少；6）无严重全身感染、恶病质、肾功能不全等；7）签署知情同意书并愿意参与本研究。

1.1.3 排除标准 1）糖尿病酮症酸中毒患者；2）急危重症患者，一般情况差不能耐受者；3）对研究用药及成分过敏者；4）癌性创面者；5）中途退出或失访，临床资料不全者。

1.2 主要材料与试剂

注射用尿激酶（武汉人福药业有限责任公司），0.9%氯化钠注射液（四川科伦药业股份有限公司），肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）测定试剂盒（美国西门子公司），白细胞介素-6（interleukin 6，IL-6）测定试剂盒（美国西门子公司），苏木素染液（武汉赛维尔生物科技有限公司），伊红染液（武汉赛维尔生物科技有限公司），Masson 染色试剂盒（武汉赛维尔生物科技有限公司），免疫组化试剂盒（武汉赛维尔生物科技有限公司），RNA simple Total RNA Kit［天根生化科技（北京）有限公司］，全蛋白提取试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），TB Green Premix Ex TaqⅡ（美国TaKaRa 公司），Ⅰ型胶原（CollagenⅠ）抗体、α-平滑肌肌动蛋白（α smooth muscle actin，α-SMA）抗体、β-actin 抗体（美国Affinity 公司）。

1.3 主要仪器设备

酶标仪（重庆博腾制药科技股份有限公司），超微量分光光度计（美国通用公司），化学发光成像系统（美国伯乐公司），荧光定量PCR 仪（德国耶拿分析仪器股份公司），数字切片扫描与应用系统（麦克奥迪实业集团公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 换药及渗液收集方法尿激酶组和对照组连续换药4 d，每次予碘伏常规消毒，生理盐水清洗创面。对照组予0.9%生理盐水外敷创面，实验组予5 000 IU·mL－1浓度尿激酶外敷创面。两组均使用海藻酸盐敷料为浸润伤口的载体，换药时敷料均完整覆盖创面，外用无菌纱布包扎。连续用药4 d，每24 h 收集创面分泌物检测IL-6、TNF-α 含量。

1.4.2 创面分泌物IL-6、TNF-α 的检测方法将装有IL-6、TNF-α 的试剂和试剂放入IMMULITE1000 化学发光免疫分析仪。将样品杯托架放在样本链上，将上述收集好的上清液500 μL 放入样品杯中。然后将样本杯放在托架上，接着放入5 个测试杯。免疫分析仪自动检测各指标。

1.4.3 创面肉芽组织评分及创面渗液评分[11]采用Likert 4 级评分法对实验前后创面肉芽组织及渗液按0～3 分进行评分，评分越高创面条件越差，见表1。

表1 慢性创面的肉芽组织及渗液评分标准

1.4.4 HE 染色常规石蜡切片脱蜡至水，放入苏木素染液中染色5 min，自来水冲洗掉多余染液。放入1%盐酸乙醇中浸泡分化3 s，自来水冲洗1 min，水洗蓝化30 min。放入伊红染液中染色，常规脱水，干片后用中性树胶封片处理。

1.4.5 Masson 染色石蜡切片脱蜡至水，Weigert 铁苏木素染色。1%盐酸乙醇浸泡分化3 s，丽春红酸性品红染料染色，再以苯胺蓝染料溶液中染色。常规脱水，干片后用中性树胶封片处理。

1.4.6 免疫组化石蜡切片脱蜡至水后进行抗原修复，滴加10%山羊血清封闭，37 ℃温箱封30 min。滴加稀释好的对应指标的一抗，孵育过夜。二抗孵育后DAB 显色，复染封片后扫描分析。

1.4.7 Western blot 准确称取创面组织50 mg，加入蛋白质裂解液lysis buffer 1 mL，玻璃匀浆仪匀浆，按说明书提取蛋白。用BCA 蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。取适量5×loading buffer 混匀，100 ℃，5 min 煮沸变性，用SDS-PAGE 电泳，浓缩胶（恒压80 V），分离胶（恒压120 V）；然后湿式转入PVDF 膜中，5% 脱脂奶粉封闭液封闭2 h，敷一抗4 ℃过夜，洗膜后加入相应二抗，孵育2 h，PBS 洗5 次。用化学发光法检测蛋白条带，计算目标蛋白条带灰度与内参照（β-actin）条带灰度之间的比值，即代表目标蛋白的相对含量。

1.4.8 RT-qPCR 常规提取RNA 后，逆转录成cDNA。按RT-qPCR 反应体系操作，CollagenⅠ引物：F 为5’-GAGGGCCAAGACGAAGACATC-3’，R 为5’-CAGATCACGTCATCGCACAAC-3’。α-SMA：F 为5’-AAAAGACAGCTACGTGGGTGA-3’，R 为5’-AAAAGACAGCTACGTGGGTGA-3’。PCR循环反应条件如下：30 s 变性（95 ℃），5 s 退火（95 ℃），30 s 延伸（60 ℃），40 个循环。采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达水平。

1.5 统计学方法

应用SPSS 24.0 统计学软件进行数据分析，计数资料组间比较采用卡方检验，计量资料以均数±标准差（）表示，两组间比较用独立样本t 检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 临床资料及尿激酶在慢性创面中应用的安全性

52 例患者检测血小板计数、凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间、凝血酶时间及纤维蛋白原，均未见异常，两组患者年龄、性别比较差异均无统计学意义（P 均>0.05），见表1。

表1 两组患者一般资料

2.2 尿激酶缓解了慢性创面炎症反应

与生理盐水组相比，尿激酶组治疗后创面渗液未见明显减少。治疗后第3、4 天，尿激酶组创面渗液的IL-6 含量少于生理盐水组（P＜0.05）治疗后第4 天尿激酶组创面渗液的TNF-α 含量少于生理盐水组（P＜0.05），见表2～表4。

表2 两组患者各时间点创面渗液评分比较（，分）

表3 两组患者各时间点创面渗液中IL-6 的含量比较（，pg·mL-1）

与生理盐水组比较*P<0.05。

表4 两组患者各时间点创面渗液中TNF-α 的含量比较（，pg·mL-1）

与生理盐水组比较*P<0.05。

2.3 尿激酶促进慢性创面新生毛细血管形成和肉芽组织生长

尿激酶组在治疗后第4 天创面肉芽组织评分优于生理盐水组（P＜0.05），尿激酶组创面肉芽组织新生血管数量多于生理盐水组（P＜0.05），见表5、表6、图1。

图1 慢性创面肉芽组织血管表达的HE 染色结果（×400）

表5 各时间点创面肉芽组织评分比较（，分）

与生理盐水组比较*P<0.05。

表6 两组创面肉芽组织新生血管数目比较（）

与生理盐水组比较*P<0.05。

2.4 尿激酶促进慢性创面生长因子VEGF、TGF-β 分泌

两组创面肉芽组织免疫组化结果显示，尿激酶组创面肉芽组织的VEGF、TGF-β 含量均高于生理盐水组（P 均＜0.05），见表7、图2、图3。

图2 慢性创面肉芽组织VEGF 表达的免疫组化结果（×400）

图3 两组慢性创面肉芽组织TGF-β 表达的免疫组化结果（×400）

表7 两组患者创面肉芽组织VEGF 的平均光密度值（AOD）值比较（）

与生理盐水组比较*P<0.05。

2.5 尿激酶促进慢性创面成纤维细胞活化，胶原蛋白合成

通过Masson 染色观察，尿激酶组创面肉芽组织中胶原蛋白排列较整齐，生理盐水组胶原蛋白排列紊乱，尿激酶组胶原蛋白含量高于生理盐水组（P＜0.05）见图4、表8。Collagen I 是创面主要的基质成分蛋白，Western blot 和RT-qPCR 结果证实尿激酶组Collagen I 表达高于生理盐水组（P＜0.05），见图5A、图5B。α-SMA 是成纤维细胞活化的标志性蛋白。慢性创面床经尿激酶干预后，Western blot 和RT-qPCR 结果显示α-SMA表达增强（P＜0.05），提示尿激酶组创面成纤维细胞活化明显增多，见图5C、图5D。

图4 两组慢性创面肉芽组织胶原蛋白表达的Masson 染色结果（×400）

图5 慢性创面肉芽组织Collagen I 和α-SMA 的蛋白与mRNA 相对表达水平

表8 两组创面肉芽组织Masson 胶原纤维的AOD 值比较（）

与生理盐水组比较*P<0.05。

3 讨论

本研究通过对慢性创面患者给予尿激酶治疗后发现，尿激酶外用于创面不影响患者的凝血功能，可以安全应用于慢性创面中，对患者后续治疗无不良影响。尿激酶缓解了慢性创面炎性反应，促进慢性创面生长因子VEGF、TGF-β 分泌。并且，有利于创面新生毛细血管形成和肉芽组织生长，促进创面成纤维细胞活化和胶原蛋白合成。总之，尿激酶价格便宜[12]、使用便捷、安全有效、在临床中可以广泛用于慢性创面的治疗。

IL-6、TNF-α 在难愈性创面的慢性化中起关键作用。慢性创面形成早期炎症因子可以趋化炎性细胞向损伤部位迁移吞噬降解细菌、异物、坏死组织[13-14]。但是，促炎因子过多会直接损伤组织细胞，阻止组织细胞对化学信号作出反应，导致促进创面愈合的生长因子减少。治疗慢性创面须采取有效的治疗手段降低炎症反应、促进创面生长，从而促进慢性创面愈合[15]。本研究应用尿激酶外敷慢性创面，结果显示，尿激酶可降低创面炎症因子IL-6、TNF-α 的含量，说明尿激酶在治疗慢性创面时，可以减少创面炎性因子，从而起到促进慢性创面改善的作用。

微循环障碍是慢性创面不愈合的重要原因之一。组织的过度破坏导致创面微血管血栓形成，血管新生受阻，组织缺血、局部灌注和氧合减少，代谢产物堆积，缺血的结果直接导致创面组织损伤加重、创面修复延迟。在慢性创面中，血小板及周围结缔组织释放TGF-β 和VEGF 等生长因子。它们不仅可以趋化巨噬细胞、中性粒细胞、成纤维细胞、内皮细胞和平滑肌细胞到受伤组织，对炎症期和增殖期有关键作用[16]，还可以调节表皮重构和细胞外基质生成，促进结缔组织再生[17]，促进肉芽组织的形成。并且，肉芽组织形成数量的多少与质量的好坏直接影响创面的修复程度。免疫组化结果提示，尿激酶组创面肉芽组织中TGF-β 和VEGF 含量较生理盐水组高。进一步研究发现，尿激酶组创面肉芽组织中新生血管多于生理盐水组，而且肉芽组织生长更好。说明尿激酶可以促进慢性创面肉芽组织中血管的生长，推测其作用机制与尿激酶的溶栓效果有关。尿激酶对导管内3～4 周的血凝块有显著溶解作用，尿激酶外敷创面可以持续发挥其生物活性。本研究还发现尿激酶组创面肉芽组织中VEGF 的含量高于生理盐水组，VEGF 是促进血管生成的主要细胞因子，对内皮细胞的迁移和增殖有重要作用，可诱导血管新生促进创面愈合[18]。以上结果提示，尿激酶应用于慢性创面，可以促进创面组织微血栓溶解，使血管再通，有效改善慢性创面的血液供应和营养支持[19]。增加了局部TGF-β 和VEGF 的含量，还可以促进血管生成，促进创面肉芽新生血管和肉芽组织生成，加速局部废物代谢，从而有助于慢性创面床的改善。

在慢性创面的重塑阶段，成纤维细胞活化为肌成纤维细胞，a-SMA 的高表达与创面成纤维细胞的活化成正相关。肌成纤维细胞分泌大量胶原蛋白，其中CollagenⅠ含量最多，它可促进细胞外基质的重塑。胶原蛋白是创面组织的重要组成，是创面愈合的结构支架，对细胞黏附、趋化和迁移有积极作用，有助于组织修复。α-SMA 与CollagenⅠ还有促进创面纤维化达到愈合的作用[20]。由此可见α-SMA、CollagenⅠ是影响创面愈合的重要因素。本研究尿激酶组创面肉芽组织Masson 染色结果显示，胶原蛋白排列较整齐，生理盐水组创面胶原蛋白较紊乱，且尿激酶组胶原蛋白含量多于生理盐水组，这可能与成纤维细胞活化有关。进一步发现，尿激酶组创面肉芽组织α-SMA 和CollagenⅠ表达较生理盐水组明显增多。提示尿激酶组创面肉芽组织成纤维细胞活化数量优于生理盐水组，进而分泌更多CollagenⅠ形成创面基质，有利于慢性创面愈合。这可能与尿激酶改善创面局部“微环境”、促进TGF-β 和VEGF 释放、进而促使成纤维细胞活化、合成胶原蛋白有关。由此可见，尿激酶对慢性创面的组织生成有重要作用。

综上所述，尿激酶可溶解慢性创面微血管中的血栓，使血管再通增加组织灌注、营养供给和加快清除代谢产物，有助于血管新生，促进创面肉芽组织生长，促进胶原沉积，降低创面炎性反应，促进上皮化。