m6A 甲基化对邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯诱导小鼠睾丸间质细胞自噬的作用

马慧颖，李 玲，2，3，郭晓英，德小明，2，3，李丽萍，2，3，郝 羽，闫凤梅

（1.宁夏医科大学公共卫生与管理学院，银川 750004；2.宁夏环境因素与慢性病控制重点实验室，银川 750004；3.生育力保持教育部重点实验室，银川 750004）

邻苯二甲酸酯类化合物（phthalic acid esters，PAEs）作为增塑剂，常被用在儿童玩具、食品外包装和医疗器械等产品的生产过程中[1]。在对中国23 个城市水源中邻苯二甲酸酯类物质浓度进行检测时发现，邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯［di-（2-ethylhexyl）phthalate，DEHP］的检出率高达87.9%[2]。在生物体内，DEHP 经过一系列酶促反应形成活性代谢产物邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯（mono-2-ethylhexyl phthalate，MEHP），MEHP具有生殖和发育毒性等[3]，其在生物组织中蓄积时间长达6 个月，因此MEHP 的毒性评估不容忽视[4]。在哺乳动物细胞中，自噬是一种非常保守的机制，自噬可介导受损的细胞成分向溶酶体传递以维持体内平衡[5]。本课题组前期研究发现，MEHP染毒能够诱导胞质内产生自噬体[6]。N6-甲基腺嘌呤（m6A）是真核细胞中最丰富的RNA 甲基化形式，研究[7]表明，m6A 甲基化在精子发生和胚胎发育中起到了重要的调控作用，m6A 去甲基化酶可影响小鼠睾丸精子的生成[8]，m6A 甲基化酶缺失导致精子发生相关基因的改变，从而使精原细胞分化等功能无法正常进行[9]。本实验通过加入甲基化抑制剂3-脱氮腺苷（3-deoxyioden osine，DAA）观察m6A 甲基化在MEHP 致小鼠睾丸间质细胞自噬中的作用，为进一步研究m6A 甲基化在PAEs中致雄性生殖毒性的作用提供理论依据和研究基础。

1 材料与方法

1.1 细胞株、主要仪器与试剂

1.1.1 细胞株 小鼠睾丸间质细胞株（TM-3）（中国科学院细胞库）。

1.1.2 主要仪器 CO2培养箱、发光成像系统、超微量紫外分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific 公司），净化工作台（苏州安泰空气技术有限公司），康宁细胞计数仪（上海康宁管理有限公司），细胞成像系统倒置生物显微镜（深圳爱可机械有限公司），高速冷冻离心机（上海力申科学仪器有限公司），多功能酶标仪（美国珀金埃尔默股份有限公司）。

1.1.3 试剂 MEHP、DMSO溶剂（美国Sigma 公司），DAA（美国Cayman Chemical 公司），DMEM、双抗、磷酸盐缓冲液（PBS）、胎牛血清（上海逍鹏生物科技有限公司），胰蛋白酶（北京索莱宝科技有限公司），CCK-8 细胞增殖检测试剂盒（上海贝博生物科技有限公司），总RNA 提取试剂盒（大连宝生物工程有限公司），m6A RNA 甲基化定量检测试剂盒（艾美捷科技有限公司），全蛋白提取试剂盒、BCA 蛋白检测试剂盒、自噬检测试剂盒、化学发光检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司），LC3 和Beclin-1 抗体（Abcam 公司）。

1.2 TM-3 细胞培养、染毒液配制及分组

复苏TM-3 细胞，每瓶加入含有10%胎牛血清、1%双抗的DMEM 培养基至4 mL，放置于37 ℃、100%相对湿度、5%CO2的细胞培养箱中，培养24～48 h 至细胞铺满培养瓶底80%，传代2～3次，在生长至对数生长期时收集TM-3 细胞，进行后续相关实验。

MEHP 染毒液配制：称取100 mg MEHP 标准品，加入1 mL DMSO 将其稀释成浓度为359.27 mmol·L-1的MEHP 溶液，其中DMSO 终浓度为0.1%，分装储存于-20 ℃条件下，依照课题组前期实验剂量[6]，加入无菌培养基，梯度稀释成对照组（0 μmol·L-1）、MEHP 低剂量组（200 μmol·L-1）、中剂量组（400 μmol·L-1）、高剂量组（800 μmol·L-1）的染毒液，现用现配。

DAA 组给予终浓度为40 μmol·L-1的DAA，DAA+MEHP 组给予40 μmol·L-1DAA+400 μmol·L-1MEHP。

1.3 CCK-8 法检测不同浓度甲基化抑制剂对细胞活力的影响

将TM-3 细胞制成单细胞悬液并进行计数，调整细胞浓度后将细胞接种到96 孔板中（每孔1×104个细胞），在37 ℃、5%CO2和100%相对湿度的CO2培养箱中培养6～8 h，待细胞贴壁后，加入浓度梯度为0（DAA 对照组）、5、10、20、40、80 μmol·L-1的DAA 继续培养24 h，避光加入适量的检测液，多功能酶标仪中37 ℃孵育0.5～1 h，检测其吸光度值，计算细胞活力[10]。

1.4 光学显微镜下观察TM-3 细胞形态、CCK-8法检测其存活率

将制成单细胞悬液的TM-3 细胞，按每孔2×105个细胞接种到6 孔板中，待细胞铺满孔底70%～80%，分别加入0、200、400、800 μmol·L-1的MEHP，40 μmol·L-1DAA 和40 μmol·L-1DAA+400 μmol·L-1MEHP 干预24 h，于光学显微镜下进行观察。加入CCK-8 检测液在450 nm波长处检测吸光度值，计算TM-3 细胞存活率。

1.5 提取TM-3 细胞总RNA 并检测不同组别染毒对m6A 甲基化水平的影响

将处于对数生长期的TM-3 细胞按每孔2×105个细胞接种到6 孔板中，待细胞铺满孔板底部70%～80%，每孔加入2 mL 不同组别的染毒液，继续培养24 h，按照总RNA 提取试剂盒说明书操作，提取TM-3 细胞的总RNA，随后准备相应数量的8 联管，使用高效RNA 结合液将TM-3细胞总RNA 结合到孔板上，利用捕捉和检测抗体在多功能酶标仪下检测450 nm 处的吸光值，并计算m6A 甲基化水平。m6A（%）＝［（ODsample-ODNC）÷S］/［（ODPC-ODNC）÷P］×100%，其中S 为样本RNA 的质量，P 为阳性对照组RNA 的质量。

1.6 丹酰尸胺（MDC）染色检测自噬

将TM-3 细胞以每孔2×104个细胞的浓度接种到24 孔板中，待细胞铺满孔板底部80%左右，加入不同组别的染毒液放入培养箱中培养24 h。洗涤缓冲液洗2 次，每孔加入100 μL 配制好的MDC 染色液，避光在室温下孵育20～30 min，洗涤缓冲液洗3 次，荧光显微镜下观察，并对每个组别进行随机拍照，用Image J 软件分析各组的荧光信号强度。

1.7 Westernblot检测TM-3细胞相关蛋白表达情况

TM-3 细胞经过不同组别染毒24 h，加入蛋白裂解液超声裂解20 min，12 000 r·min-1离心5 min，收集上清为TM-3 细胞的全蛋白，用BCA试剂盒和多功能酶标仪检测蛋白浓度，配制合适的蛋白上样体系。根据蛋白分子质量进行配胶、电泳、转膜、脱脂奶粉封闭，1×PBST 清洗后，加入相应的一抗稀释液（LC3 为1∶2 000；Beclin-1 为1∶5 000）放在4 ℃冰箱孵育过夜，使用洗膜液清洗3 次，在室温下孵育二抗1～2 h，洗膜30 min后配制ECL 发光液对目的条带进行曝光。应用Image J 软件对目的蛋白进行灰度值分析。

1.8 统计学方法

采用GraphPad Prism 9 和SPSS 26.0 软件对实验数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），两两比较采用LSD-t 检验。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度甲基化抑制剂对TM-3 细胞活力的影响

随着DAA 浓度的增加，TM-3 细胞活力先增加后降低，当DAA 浓度为5、10、20、40 μmol·L-1时，细胞活性分别为（104.36±14.01）%、（101.26±11.04）%、（99.24±8.70）%、（97.43±7.49）%，与DAA 对照组相比均无明显变化（P＞0.05）；当DAA浓度为80 μmol·L-1时，细胞活性为（84.94±5.95）%，较DAA 对照组降低（P＜0.01），见图1。

图1 不同浓度DAA 对TM-3 细胞活力的影响

2.2 不同染毒方式对TM-3 细胞形态的影响

MEHP 对照组TM-3 细胞大多为梭形和多边形，细胞间排列较密集，MEHP 染毒组随着剂量加大，各细胞间的空隙变大，圆形细胞变多，贴壁细胞的数量明显减少，DAA+MEHP 组与中剂量MEHP 组相比，细胞发生皱缩，细胞间隔稍有增大，见图2。

图2 不同组别对TM-3 细胞形态的影响（×100，标尺为270 μm 处）

2.3 不同组别染毒对TM-3 细胞活力的影响

不同组别染毒24 h 测定其吸光度值，结果显示，与MEHP 对照组相比，MEHP 低、中、高剂量组和DAA+MEHP 组TM-3 细胞活力均下降（P均＜0.01），与MEHP 中剂量组相比，MEHP+DAA组细胞活力下降（P＜0.01），见表1。

表1 不同组别染毒对TM-3 细胞活力的影响

2.4 不同浓度MEHP 对TM-3 细胞RNA 甲基化m6A 修饰的影响

TM-3 细胞经过不同浓度MEHP 处理24 h，MEHP 组对照，低、中、高剂量总体m6A 甲基化水平依次为（0.070 7±0.001 4）%、（0.055 3±0.000 5）%、（0.042 97±0.001 8）%和（0.039 5±0.001 0）%，与MEHP 对照组相比，各组m6A 修饰水平均降低（P 均＜0.01），见图3。

图3 不同浓度MEHP 对TM-3 细胞m6A 修饰水平的影响

2.5 甲基化抑制剂对TM-3 细胞RNA 甲基化m6A 修饰的影响

DAA 组m6A 修饰水平为（0.038 5±0.002 2）%，与MEHP 对照组相比下降（P＜0.01）；DAA+MEHP组m6A 修饰水平为（0.024 1±0.001 6）%，与MEHP中剂量组相比降低（P ＜0.01），如图4。由于40 μmol·L-1DAA 在明显降低TM-3 细胞的m6A修饰水平的同时对细胞损伤较小，因此后续DAA 的干预剂量为40 μmol·L-1。

图4 甲基化抑制剂对TM-3 细胞m6A 修饰水平的影响

2.6 不同浓度MEHP 及甲基化抑制剂对TM-3细胞自噬发生的影响

MDC 荧光染色结果显示，与对照组相比，MEHP低剂量组荧光信号强度为（26.07±8.35），两者比较差异无统计学意义（P＞0.05）；MEHP 中、高剂量组和DAA 组荧光信号强度分别为（77.96±8.79）、（127.56±4.65）和（77.79±43.95），与对照组相比增强（P＜0.01）；DAA+MEHP 组荧光信号强度为（112.03±2.45），较MEHP 中剂量组增强（P＜0.05），见图5。

图5 不同处理条件下TM-3 细胞MDC 的荧光强度

2.7 不同浓度MEHP 对TM-3 细胞自噬相关蛋白表达量的影响

与对照组相比，MEHP 各染毒组LC3-Ⅱ的表达量均升高（P＜0.05），伴随着染毒剂量增大，呈逐渐上升的趋势，MEHP 低剂量组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ无明显改变（P＞0.05），MEHP 中、高剂量组LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ的比例升高（P＜0.01）。MEHP低剂量组Beclin-1 的表达量与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05），MEHP 中、高剂量组Beclin-1 的表达量较对照组升高（P＜0.01），见图6。

图6 不同浓度MEHP 对TM-3 细胞自噬相关蛋白表达量的影响

2.8 甲基化抑制剂对TM-3 细胞自噬相关蛋白表达情况的影响

不同处理条件Western blot 结果及定量分析结果显示，与对照组相比，DAA+MEHP 组和DAA组LC3-Ⅱ的表达水平均升高（P 均＜0.01），DAA组LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ无明显变化（P＞0.05），DAA+MEHP 组LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ升高（P＜0.01）。DAA+MEHP 组和DAA 组Beclin-1 的表达水平较对照组均上升（P 均＜0.01），见图7。

图7 甲基化抑制剂对TM-3 细胞自噬相关蛋白表达量的影响

3 讨论

表观遗传学在内分泌干扰物致人类健康损害中起着重要的作用[11]，其中RNA 甲基化在转录后水平调节基因表达，其作用不容忽视。m6A修饰主要分布在3’非翻译区域、近终止密码子和长外显子区域[12]，能够调控RNA 稳定性、选择性剪接、翻译及核转运等。相关研究[13]发现，机体暴露于环境污染物后，其DNA 甲基化水平、DNA羟甲基胞嘧啶、RNA 甲基化水平以及相关调节基因均发生改变。另有研究[14]表明，在睾丸间质干细胞分化的过程中观察到了METTL14 降低和ALKBH5 增加，导致睾丸间质细胞中m6A 甲基化水平降低，自噬增加。

自噬是一种将自噬体与溶酶体融合进行降解的分解、代谢过程，以满足细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新[15]。自噬相关基因，在调节自噬过程中发挥重要作用[16]，其中LC3 包括LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ两种，两者之间可以互相转换，LC3-Ⅱ定位于自噬体膜，常用来判断细胞的自噬水平[17]。在哺乳动物中，Beclin-1 是酵母Atg6 的同源物，其促进形成自噬体膜从而对自噬进行调控[18]。本实验通过CCK-8 法检测不同组别染毒24 h 后TM-3 细胞的存活率，结果显示，随着染毒剂量的增加，TM-3 细胞存活率不断下降，DAA+MEHP组细胞存活率较MEHP 中剂量组降低。光学显微镜下观察细胞形态，结果显示，对照组TM-3 细胞大多为梭形和多边形，细胞间排列较紧密，随着MEHP 染毒剂量的加大，细胞间的空隙变大，圆形细胞变多，贴壁细胞的数量减少，DAA+MEHP组TM-3 细胞发生皱缩，细胞间隔较MEHP 中剂量组稍有增大。使用m6A RNA 甲基化定量检测试剂盒检测不同处理条件下TM-3 细胞m6A 修饰的水平，结果提示，随着MEHP 染毒剂量的增加，m6A 修饰水平降低，并且呈现出剂量依赖性趋势；DAA+MEHP 组m6A 修饰水平与MEHP 中剂量组相比降低；DAA 组m6A 修饰水平较对照组下降。既往研究[19]报道，RNA 甲基化的主要功能是促进mRNA 代谢以维持细胞自我更新，m6A水平降低与癌症进展和低存活率密切相关，这与本研究结果相互验证。MDC 是一种嗜酸性染色剂，通常用来检测自噬体形成，自噬小体可被染成蓝色[20]。本实验利用MDC 染色法在荧光显微镜下观察自噬小体形成，结果显示：对照组荧光信号强度最弱，说明正常的TM-3 细胞中只有极少数的自噬小体，MEHP 低剂量组与对照组相比，荧光信号强度无明显变化，而MEHP 中、高剂量组荧光信号强度明显增强；DAA+MEHP 组荧光信号强度较中剂量MEHP 组呈上升趋势；DAA 组荧光信号强度与对照组相比增强。本课题组前期研究[6，21]发现，一定剂量MEHP 染毒可通过PTEN/AKT 信号通路正向调节小鼠睾丸间质细胞自噬。Liu 等[22]研究发现，邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯依赖ROS 通过Akt1 途径诱导人血管内皮细胞自噬。另有研究[23]表明，MEHP 的原型DEHP 导致小鼠睾丸间质细胞自噬和凋亡，并且自噬在DEHP 诱导的细胞凋亡中发挥了重要的毒性作用。本研究也发现，MEHP 各剂量组LC3-Ⅱ的表达水平与对照组相比均升高；与对照组相比，MEHP 低剂量组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1 的表达水平无明显变化，而中、高剂量MEHP 组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1 的表达水平均升高。DAA+MEHP 组和DAA 组LC3-Ⅱ和Beclin-1 的表达水平均升高，DAA+MEHP 组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例也升高。说明一定浓度的MEHP 能引起TM-3 细胞中自噬小体的积累；DAA 作为甲基化抑制剂，能够降低整体m6A 修饰的水平，进而导致自噬小体的累积。Wang 等[24]研究发现，硫酸吲哚氧基通过调节RNA 中的肥胖相关蛋白（FTO）和m6A 甲基化来激活自噬通量，3-脱氮腺苷抑制m6A 甲基化后可以阻断硫酸吲哚氧基对细胞自噬激活的影响，上述发现与本研究结果相似。有研究显示，敲除m6A 去甲基化酶FTO 后，降低了Atg5 和Atg7 的表达水平，导致自噬体形成减少，最终自噬被抑制[25]。

综上所述，MEHP 可能通过降低RNA 甲基化m6A 修饰的水平来诱导TM-3 细胞发生自噬，这些发现揭示了m6A 甲基化在MEHP 致TM-3 细胞自噬中的重要作用，为邻苯二甲酸酯类与雄性生殖毒性的相关性研究提供研究基础，但关于PAEs 的雄性生殖毒性的作用机制还有待进一步探索与研究。