敲低Piezo2 对人结肠癌细胞HCT116 和SW620增殖、迁移和侵袭的影响

张浩鹏，张丽君，纪 琴，侯少华，常 鑫，李 海

（1.宁夏医科大学临床医学院，银川 750004；2.济宁医学院附属医院兖州院区呼吸内科，济宁 272000；3.宁夏医科大学总医院结直肠外科，银川 750004）

细胞运动和侵袭以及肿瘤发生和转移是癌症恶性潜能的特征，转移是导致癌症死亡的主要原因[1]，大约15%的结直肠癌患者发生转移后，其平均生存时间不到3 年[2]。肿瘤微环境可以促进肿瘤的进展[3]，来自原发性肿瘤的机械应力可诱导非转化的相邻细胞群中的致瘤信号传导，进而促进细胞生长和肿瘤增加。同时，生物力学可以通过在转化细胞中诱导间充质样开关来驱动肿瘤攻击，使它们获得肿瘤起始特性[4]。Piezo2 作为机械力活化的离子通道，将机械应力-细胞内信号-癌症紧密地联系在一起，参与结直肠癌的发生发展。本研究主要通过对人结肠癌细胞系SW620和HCT116 细胞的Piezo2 表达进行干预，检测两种细胞在干预前后增殖、迁移、侵袭能力的变化。

1 资料与方法

1.1 细胞与主要试剂

NCM460（人正常结肠上皮细胞系）、SW480（原发结肠腺癌细胞系）、HCT116（原位肠癌细胞系）和SW620（结肠癌淋巴结转移细胞系）均购于美国ATCC 细胞库。RPMI-1640 培养基（美国GIBCO 公司），McCoy’s 5A 培养基（美国GIBCO 公司），Leibovitz’s L-15 培养基（美国GIBCO 公司），蛋白含量检测试剂盒、凯基全蛋白提取试剂盒、彩色蛋白Maker（江苏凯基生物技术有限公司），胎牛血清（BI 公司），PVDF 膜（美国密理博公司），Transwell 小室（CORNING 公司），ki67 抗体（Abcam 公司），重组慢病毒LV-Piezo2-RNAi、阴性对照病毒CON313、HiTransGP 病毒感染试剂（上海吉凯基因医学科技有限公司），Trizol 试剂（美国赛默飞公司），反转录-荧光定量试剂盒（天根生化科技北京有限公司），Piezo2 及GAPDH 引物由上海生物工程有限公司设计合成，GAPDH 抗体（北京博奥森生物技术有限公司），Piezo2 抗体（Abcam 公司）、HRP Goat Anti-Rabbit IgG（ABclonal 公司）、Western blot 高敏型ECL 化学发光检测试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）。

1.2 实验分组

阴性对照组（LV-NC）为阴性慢病毒转染的稳定细胞系，转染敲低组（LV-shPiezo2）为慢病毒敲低Piezo2 的稳定转染细胞系。

1.3 实验方法

1.3.1 实时荧光定量PCR 检测癌组织及癌旁组织Piezo2 的mRNA 表达 使用Trizol 试剂提取组织和细胞中的总RNA，运用反转录试剂盒将RNA 逆转录成cDNA，运用SYBRTMGreen Mix 试剂进行实时荧光定量PCR 实验，引物序列为：Piezo2：正向：5’－ ATGGCCTCAGAAGTGGTGTG－3’，反向：5’－ATGTCCTTGCATCGTCGTTTT－3’；GAPDH：正向：5’－AATGGACAACTGGTCGTGGAC－3’，反 向：5’-CCCTCCAGGGGATCTGTTTG－3’。反应条件为：在PCR 仪中预变性10 min、95 ℃1 个循环，然后95 ℃15 s，62 ℃30 s 进行40 个循环。mRNA 相对表达水平的计算采用2-ΔΔCt 法。

1.3.2 蛋白免疫印迹实验检测癌组织及癌旁组织Piezo2 的蛋白表达 取组织或者细胞，RIPA裂解液提取蛋白后用BCA 试剂盒进行蛋白定量，取40 μg 总蛋白进行SDS-PAGE 电泳，然后将蛋白转膜到PVDF 膜上，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入稀释后一抗4 ℃孵育过夜，次日用TBST 洗膜3 次，每次10 min，加入稀释后二抗室温孵育1 h，TBST 洗膜3 次，每次10 min，滴加高敏ECL 化学发光液后于化学发光仪下曝光拍照，以目的蛋白与内参蛋白积分灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

1.3.3 Piezo2 敲低慢病毒转染HCT116 和SW620 细胞 按照慢病毒转染试剂说明书，将HCT116 细胞和SW620 细胞密度调整至3×104个/mL，取500 μL 加入24 孔板，细胞密度在20%～30%时加入对应感染复数（MOI）的慢病毒，转染Piezo2 敲低慢病毒和对照空载慢病毒于HCT116细胞和SW620 细胞中，然后用嘌呤霉素筛选转染敲低Piezo2 的HCT116 细胞和SW620 细胞，进而得到稳定敲低的HCT116 和SW620 细胞。

1.3.4 CCK-8 法检测细胞增殖 在96 孔板中加入100 μL（细胞量约为7 000 个）的HCT116、SW620 细胞悬液。培养板在培养箱预培养24 h（在37 ℃，5%CO2的条件下）。细胞培养至相应时间（0、6、12、24、48、60、72 h）分别加入10 μL 的CCK-8 溶液，将细胞继续培养2 h，用酶标仪测定在450 nm 处的光密度（OD）值。

1.3.5 Transwell 法检测细胞侵袭能力 提前将用不含血清的McCoy’s 5A 和Leibovitz’sL-15 培养基稀释的matrigel 胶（1 mg·mL-1）铺到小室上层底部，将转染前后HCT116 和SW620 细胞，用不含血清的McCoy’s 5A 和Leibovitz’sL-15 培养基将细胞调整至浓度为1×105个/mL 的细胞悬液，向24 孔Transwell 小室的上层加入200 μL细胞悬液。随后向小室下层加入500 μL 含有10%FBS 的McCoy’s 5A 和Leibovitz’s L-15 培养基，培养箱孵育24 h。小室从培养箱取出，吸净小室上下层的培养基，用干净棉签以适当力度擦去Transwell 上层小室内残留的基质胶、细胞，多聚甲醛固定，结晶紫染色，水分风干后显微镜拍照并使用Image J 软件进行细胞计数。

1.3.6 细胞划痕实验检测细胞迁移能力 取LV-NC 组和LV-shPiezo2 组的HCT116 和SW620细胞，按5×105个/mL 细胞密度接种于6 孔板中，每孔1 mL，于培养箱内培养，待细胞汇合度达到80%～90%时，使用100 μL 移液枪头对6 孔板进行划痕，PBS 清洗后加入相应的McCoy’s 5A 和Leibovitz’s L-15 无血清培养基，按时间点0、24 h 进行拍照，使用Image J 图像分析软件比较细胞划痕的间距。

1.3.7 裸鼠皮下移植瘤模型制备及其增殖能力检测 选用3 周龄的BALB/c-Nude 裸鼠，待裸鼠适应环境后开始实验。选择对数生长期且状态良好的未处理的以及分别转染敲低Piezo2 和空载慢病毒的HCT116 和SW620 细胞，常规消化并计数，用无血清培养基调整密度至1×107个/mL 的细胞悬液置于冰上待用。用1 mL 注射器抽取0.2 mL（2×106个细胞）皮下接种于一侧腋下，接种后每周3 次观察，并记录肿瘤的大小和质量，直至第3 周肿瘤大小成型后处死裸鼠并测量肿瘤体积和质量。

1.3.8 免疫组织化学法 检测皮下肿瘤中ki67表达。裸鼠皮下移植瘤，石蜡包埋固定，切片，烤片3 h 脱蜡、脱水，柠檬酸盐高压修复后3%H2O2室温孵育以消除内源性过氧化物酶的活性，10%正常山羊血清封闭后滴加一抗ki67（1∶300）工作液，4 ℃下孵育过夜，抗鼠二抗孵育1 h，苏木素染色、盐酸乙醇分化、清水反蓝，脱水，二甲苯透明后中性树胶封片，于Leica 正置显微镜下观察并拍照，使用Image J 和GraphPad Prism 8.0 统计软件作图。结果判定标准：ki67 染色标准以细胞核出现清晰棕色或棕褐色、棕黄色颗粒为阳性细胞。

1.4 统计学方法

采用Image J 和GraphPad Prism 8.0 软件进行细胞计数和统计分析绘图，计数资料比较用χ2检验。计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较用Student’s t-test、单因素方差分析。检验水准取α=0.05。

2 结果

2.1 在人结直肠癌组织中Piezo2 高表达、癌旁组织中低表达

通过RT-qPCR 及Western blot 实验分别检测癌组织及其相应癌旁组织中Piezo2 的mRNA和蛋白表达情况，结果显示,癌组织Piezo2 的mRNA 和蛋白相对表达量高于癌旁组织（P 均＜0.01），见图1。

图1 RT-qPCR 与Western blot 检测人结直肠癌组织与癌旁组织的Piezo2 表达

2.2 Piezo2 蛋白在NCM460、SW480、HCT116 和SW620 中的表达情况

Piezo2 蛋白在结肠癌细胞（SW480、HCT116 和SW620）中的表达高于癌旁上皮细胞（P 均＜0.05），见图2。

图2 Western blot 检测NCM460、SW480、SW620、HCT116 细胞的Piezo2 蛋白表达（n=3）

2.3 Piezo2 敲低慢病毒转染HCT116 和SW620细胞系

为了进一步研究Piezo2 在结直肠癌发生中的作用和调节机制，选择以上筛选的HCT116 和SW620 细胞系作为研究对象，稳定转染Piezo2 敲低慢病毒载体，利用RT-qPCR、Western blot 方法检测转染HCT116 和SW620 细胞中Piezo2 的表达，结果显示，在HCT116 与SW620 细胞内成功敲低Piezo2，见图3。

图3 RT-qPCR 与Western blot 检测人结直肠癌细胞HCT116 与SW620 的Piezo2 表达

2.4 敲低Piezo2 抑制结肠癌细胞的增殖

CCK-8 检测结果显示，与LV-NC 组相比，敲低Piezo2 的LV-shPiezo2 组的HCT116 和SW620细胞的增殖均被抑制（P 均＜0.01），见图4。

图4 CCK-8 检测敲低Piezo2 的HCT116 和SW620 细胞的增殖能力

2.5 敲低Piezo2 抑制结肠癌细胞的侵袭

Transwell 细胞侵袭实验表明，与LV-NC 组相比，敲低Piezo2 的LV-shPiezo2 组的HCT116和SW620 细胞的侵袭力被抑制（P 均＜0.01），见图5。

图5 Transwell 检测敲低Piezo2 的HCT116 和SW620 细胞的侵袭能力

2.6 敲低Piezo2 抑制结肠癌细胞迁移

细胞划痕实验显示，与LV-NC 组相比，敲低Piezo2 的LV-shPiezo2 组的HCT116 和SW620 细胞的迁移均被抑制（P 均＜0.01），见图6。

图6 划痕实验检测敲低Piezo2 的HCT116 和SW620 细胞的迁移能力

2.7 敲低Piezo2 抑制结肠癌细胞体内致瘤性

将LV-NC 组与LV-shPiezo2 组的HCT116细胞、LV-NC 组与LV-shPiezo2 组的SW620 细胞分别接种至BALB/c－Nude 裸鼠一侧腋下，皮下成瘤结果显示，接种LV-shPiezo2 组细胞的小鼠肿瘤体积小于LV-NC 组，LV-shPiezo2 组肿瘤质量少于LV-NC 组（P 均＜0.01），见图7。免疫组织化学检测显示，接种LV-shPiezo2 组小鼠肿瘤组织中的ki67 表达低于LV-NC 组（P＜0.001），见图8。

图7 接种敲低Piezo2 的HCT116 和SW620 细胞小鼠肿瘤体积和质量比较

图8 接种敲低Piezo2 的结肠癌细胞小鼠肿瘤组织中ki67 的表达

3 讨论

机械信号在肿瘤的侵袭转移中扮演了重要角色，其中在CRC 的侵袭转移中机械信号Piezo2上调。结直肠癌中Piezo2 敲低后可能介导了Ca2+信号传导的衰减，同时通过调节钙信号激活的钙调神经磷酸酶/NFAT1 信号通路抑制了CRC 细胞的增殖和迁移，并在体内实验中抑制结直肠肿瘤的生长。Piezo2 的高表达与癌症增殖和血管生成有关[5]。肿瘤新血管参与肿瘤组织O2和营养的供应，清除肿瘤组织中CO2和代谢产物[6]。肿瘤脉管系统是肿瘤细胞转移到远处器官的主要途径之一。敲除Piezo2 后，人脐静脉内皮细胞的增殖、迁移能力以及肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力均下降[7]。说明敲除Piezo2 可影响内皮细胞和肿瘤细胞功能。Piezo2 敲除后可降低胶质瘤的血管生成和血管高通透性，抑制血管渗漏和肿瘤血管生成。敲除Piezo2 还减少血管内皮生长因子（VEGF）或白细胞介素-1β 介导的病理性血管生成，并可使胞内Ca2+改变，Wnt11/β-catenin 信号下调，内皮细胞血管生成活动发生改变[8]。

侵袭转移为恶性肿瘤的重要特征，是引起肿瘤患者死亡的首要因素，多数癌症患者死于转移癌[9]。Piezo2 在多种肿瘤疾病中高表达，其可通过调节钙离子的变化进而引起结肠炎[10]，而结肠炎在结肠癌的发生中起重要作用。Piezo2 在多种肿瘤中高表达，通过影响钙离子变化进而参与肿瘤的发生发展。Piezo2 的表达水平与癌症患者的预后紧密相关，并且Piezo2 通过调节T 细胞功能和影响免疫相关因子在肿瘤微环境中发挥潜在作用[11]。Piezo2 也导致三阴性乳腺癌患者转移增加和较差的临床预后[12]。本研究验证Piezo2 在结肠癌组织中高表达，选用稳定高表达Piezo2 的结肠癌细胞系（HCT116 和SW620）后，通过慢病毒敲低两种细胞系的Piezo2 表达，发现敲低组细胞的增殖、迁移和侵袭能力都较未处理组降低。因此推测Piezo2 在肿瘤增殖、侵袭转移能力方面起重要作用。裸鼠皮下成瘤结果也显示，敲低Piezo2组肿瘤体积和质量低于未处理组。并且免疫组化检测显示，敲低Piezo2 后ki67 表达降低，敲低Piezo2 可抑制结肠癌细胞体内致瘤性，进一步证明了Piezo2 对结直肠癌增殖、侵袭、转移的影响，但具体的产生机制需要进一步的研究。以上结果初步证实了本研究的猜测，也为下一步探究Piezo2 在CRC 中的分子机制提供了有力的数据支撑。

Piezo2 及其下游的信号通路可能在CRC 进展中起重要的作用，本研究初步证明了Piezo2 调节CRC 细胞增殖、侵袭、迁移的作用，提示Piezo2可能成为临床CRC 诊断和预后的生物标记物，可能是用于癌症治疗的新靶点，但其作用和机制还需更进一步研究。