中药活性成分对产ESBLs大肠埃希菌增敏效应研究

王威锋，霍思懿，张 彤，翟天翔，孙嘉琪，宋巧兮，云巾宴

（吉林农业科技学院动物科技学院，吉林 132109）

我国养殖业为保证畜禽等经济动物健康，大量使用抗菌药物，而这种对抗菌药物的过度与不规范使用，使我国成为世界上畜禽病原菌耐药情况最为严重的国家之一。在此背景下，针对病原菌耐药性的研究受到越来越多科研工作者的关注。超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrum β-lactamase，ESBLs）是一类能水解青霉素类、头孢菌素类、单环酰胺类的β-内酰胺酶，能够被克拉维酸、舒巴坦等β-内酰胺酶抑制剂所抑制的酶，被认为是临床上重要的多耐药菌[1-2]。实践证实，新型抗菌药物的更新革代导致β-内酰胺酶种类增多，尤其是产ESBLs的大肠杆菌和肺炎克雷伯菌感染所导致发病率、死亡率增加以及治疗感染的成本显著提高，已成为临床耐药性细菌感染的主要问题之一，对畜禽乃至人类的健康构成了严重的威胁[3-4]。只依靠对药物化学结构改造、研究和开发新型抗菌药物等手段，往往很难从根本上解决细菌耐药性的问题，只有从多方面开展饲料端“禁抗”，养殖端“限抗”，并以植物提取物“替抗”，才有可能为全面“饲料禁抗”做好准备，从而减少由于抗生素滥用造成的危害[5]。中药作为人类文明的瑰宝，成分复杂，不易导致细菌产生耐药突变，具有抗菌药物不能比拟的优势。研究表明，中药对产ESBLs致病菌有一定的抑杀作用，且不易产生耐药性，极具开发潜力[6-8]。因此，发掘具有抗耐药活性的中药是解决细菌耐药性、防控产ESBLs致病菌感染问题的重要研究方向[9-10]。

本研究通过探索小檗碱、黄芩苷、没食子酸、异甘草酸、原儿茶酸及丁香酚6种中药活性成分对吉林地区猪源产ESBLs大肠埃希菌抑菌效果，并将候选提取物与常用抗菌药物联合应用，以观察产ESBLs大肠埃希菌对抗菌药物敏感性的变化，为吉林地区仔猪感染产ESBLs大肠埃希菌的治疗、推动抗菌药物的适量与规范使用及保障动物产品安全提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株：产ESBLs大肠埃希菌分离自吉林市一病死猪，经分离鉴定后，保存于吉林省预防兽医学重点实验室/吉林农业科技学院药理与病理实验室。

供试试剂：中药提取物小檗碱（A052）、黄芩苷（A0016）、没食子酸（A0010）、原儿茶酸（A0617）、异甘草酸（A0463）、丁香酚（A0074）均购于河南奥科标准物质科技有限公司；抗菌药物链霉素、恩诺沙星、亚胺培南、美罗培南、多西环素、头孢西丁钠、庆大霉素及安普霉素均购于杭州微生物试剂有限公司，执行标准WS/T125-1999；ESBLs显色培养基购于法国科玛嘉。

1.2 试验方法

1.2.1 产ESBLs大肠埃希菌耐药性测定 采用（K-B）药敏纸片扩散法检测产ESBLs大肠埃希菌对不同抗菌药物的敏感程度。取保存菌液10 µL于10 mL LB液体培养基中37 ℃震荡培养6 h，吸取100 µL均匀涂板于LB琼脂培养基，3～5 min后用眼科镊将药敏纸片（头孢曲松、青霉素、头孢他啶、四环素、庆大霉素、红霉素、诺氟沙星、左旋氧氟沙星、多西环素、磺胺异噁唑）贴于LB平板上，倒置并放入37 ℃恒温培养箱17 h，测定抑菌环直径，根据美国临床实验室标准化协会（CLSI）2017年标准，判断其对抗菌药物的耐药性[11]。

1.2.2 中药活性成分及常用抗菌药物对产ESBLs大肠埃希菌最小抑菌浓度（MIC）测定 采用倍比稀释法，将小檗碱、黄芩苷、没食子酸、原儿茶酸、异甘草酸及丁香酚6种中药活性成分在96孔板中稀释至终浓度为0、1、2、4、8、16、32、64、128、256、512 µg/mL，并依次在对应的孔中加入浓度为1.0×105 cfu/mL的菌悬液10 µL，每孔终体积为200 µL。其中第11孔为阳性对照，无药物处理；第12孔为阴性对照，仅加入LB液体培养基。37 ℃培养16 h后用酶标仪检测620 nm处吸光度，计算中药活性成分的MIC[12]。

1.2.3 常用抗菌药物对产ESBLs大肠埃希菌MIC测定 采用二倍稀释法，将链霉素、恩诺沙星、亚胺培南、美罗培南、多西环素、头孢西丁钠、庆大霉素、安普霉素8种抗菌药物按其初始浓度倍比稀释，操作步骤同1.2.2。

1.2.4 中药活性成分联合常用抗菌药物抗菌效果 由于中药有效成分的亚抑菌浓度对菌株没有抑制或杀灭作用，因此可在亚抑菌浓度时探究中药有效成分改变耐药菌敏感性方面的效果。联合传代是以中药有效成分的亚抑菌浓度（1/2MIC）联合2倍MIC的抗菌药物（链霉素、恩诺沙星、亚胺培南、美罗培南、多西环素、头孢西丁钠、庆大霉素、安普霉素）来观察抗菌药物MIC的变化过程。将1 mg/mL的中药有效成分贮存液以亚抑菌浓度稀释至96孔板中，随后将抗菌药物以2MIC二倍稀释至96孔培养板中，加入1×105 cfu/mL菌液10 µL，37 ℃恒温箱培养16 h，检测620 nm处吸光度；在随后的第二代及第三代培养过程中，抗菌药物与中药活性成分稀释操作同上述一致，但第二代接种的菌液来自第一代培养液，第三代接种菌液来自第二代培养液。

2 结果与分析

2.1 产ESBLs大肠埃希菌耐药性

由表1可知，选取10种不同类型抗菌药物对产ESBLs大肠埃希菌药物敏感性进行鉴定，结果表明产ESBLs大肠埃希菌对庆大霉素介于耐药与敏感之间，对另外9种抗菌药物表现为耐药，说明产ESBLs大肠埃希菌具有普遍耐药性。

表1 产ESBLs大肠埃希菌药物敏感性鉴定结果

2.2 中药活性成分对产ESBLs大肠埃希菌的MIC

通过对中药有效成分MIC测定可知，其对产ESBLs大肠埃希菌均有不同程度的抑菌效果，小檗碱、黄芩苷、没食子酸及丁香酚抑菌效果较好，其中小檗碱在浓度为16 µg/mL时可完全杀菌，丁香酚在浓度为64 µg/mL时可完全杀菌，黄芩苷和没食子酸的MIC为256 µg/mL，而原儿茶酸、异甘草酸抑菌效果较差，MIC高于512 µg/mL（见表2）。

表2 中药活性成分对产ESBLs大肠埃希菌的MIC

2.3 常用抗菌药物对产ESBLs大肠埃希菌的MIC

各种抗菌药物的MIC如表3所示，选取8种抗菌药物对产ESBLs大肠埃希菌药物的MIC进行测定，结果表明美罗培南抑菌效果最好，当其浓度达到5 µg/mL时可有效抑制细菌生长，安普霉素、多西环素、亚胺培南具有较强抗菌效果，8种抗菌物质均具有抗菌效果，庆大霉素抗菌效果最差。

表3 抗菌药物对产ESBLs大肠埃希菌的MIC

2.4 中药提取物亚抑菌浓度对产ESBLs大肠埃希菌增敏效应

通过对比不同作用时间和不同药物浓度作用下耐药菌株对抗菌药物敏感性的变化，小檗碱和没食子酸对产ESBLs大肠埃希菌的最佳逆转条件如表4、表5所示。在小檗碱的亚抑菌浓度为8 µg/mL时，培养16 h可不同程度恢复产ESBLs大肠埃希菌对ENR、MMP、DOX、FOX、GEN及APR敏感性，其中GEN、APR、MMP的敏感性提高百倍以上。亚抑菌浓度下的小檗碱与各个抗菌药物联合作用于耐药大肠杆菌后，随着传代次数增加其增敏效应更加突出，其中MMP、GEN、APR的MIC分别达到0.02、1.25、0.0234 µg/mL。

表4 亚抑菌浓度的小檗碱对产ESBLs大肠埃希菌耐药性的影响

表5 抑菌浓度的没食子酸对产ESBLs大肠埃希菌耐药性的影响

当没食子酸的亚抑菌浓度为128 µg/mL时，培养16 h可不同程度恢复产ESBLs大肠埃希菌对ENR、MMP、FOX、GEN及APR敏感性，其中GEN、APR、MMP对产ESBLs大肠埃希菌的敏感性提高百倍以上。亚抑菌浓度下没食子酸在与各个抗菌药物联合作用于耐药大肠杆菌后，随着传代次数增加其作用更加突出。

3 讨 论

目前，中药抗菌及降低其耐药性的研究已经取得了一定程度的进展[13]。生物碱类药物苦豆子碱对耐β-内酰胺酶的大肠埃希菌有较好的抑菌活性[14-15]。王月玲[16]研究表明硫酸黄连素对产ESBLs大肠埃希菌的抑菌效果较好，硫酸黄连素的MBC为32～128 mg/mL，且与头孢他啶的联合用药表现为相加作用。帅丽华等[17]通过体外联合抗菌试验发现，黄连提取物和盐酸小檗碱能明显降低阿米卡星的MIC，进而提高阿米卡星的抗菌效果。吕世明等[18]研究表明苦参碱能抑制ESBLs活性，从而降低头孢类抗菌药物对产ESBLs大肠埃希菌的MIC。刘增援[19]从救必应中提取的总黄酮可明显抑制大肠杆菌的生长，并且随着浓度升高呈剂量依赖性的抑菌、杀菌作用，且与CRO、CAZ、CEF、CTX、AK、FFC等联合作用后FICI均处于0～0.5，表现为协同作用。可通过破坏大肠杆菌细胞壁、细胞膜结构，抑制或消除大肠杆菌总蛋白合成而发挥作用。黄芩苷、槲皮素及木犀草素作为黄酮类化合物可显著降低抗菌药物对产ESBLs大肠埃希菌的MIC值，呈较好的抗菌特性。此外，石科[20]研究中连翘苷和白芍苷对大肠埃希菌均有明显的体外抑菌效果，而白芍苷抑菌作用更强。吕世明等[18]研究表明，芦荟大黄素、香紫苏醇及大蒜素等中药单体成分可通过降低头孢类抗菌药物对产ESBLs大肠埃希菌的MIC，进而协同抑制ESBLs活性，汪怡倩等[9]研究也证实了中药对产ESBLs致病菌的抑杀作用，且极具开发潜力[21-22]。由此可见，很多中药有效成分均具有较强的抗菌活性，而与抗菌药物联用，能减少药物用量，发挥协同增效作用。

本研究比较6种中药提取物联合抗菌药物对产ESBLs大肠埃希菌的抑菌效果，小檗碱、黄芩苷、没食子酸及丁香酚在亚抑菌浓度时与抗菌药物联用对产ESBLs大肠埃希菌进行传代试验表明，菌株的MIC随着传代次数的增加而降低，传代三代后MMP、GEN、APR的MIC<2 µg/mL，其最小抑菌浓度降低200倍以上，产ESBLs大肠埃希菌在中药活性成分亚抑菌浓度与抗菌药物的联合传代培养中，未表现出耐药程度升高，相反其耐药程度在联合传代之后有所下降，表明亚抑菌浓度的中药活性成分具有与抗菌药物协同或相加的作用，亦可能存在亚抑菌浓度的中药活性成分破坏或降低产ESBLs大肠埃希菌耐药机制及耐药性的作用，但其作用机制有待进一步探讨。

抗菌药物与亚抑菌浓度的小檗碱、没食子酸联合用药，传代培养耐药菌株之后，其抑制作用均有所增强。联合传代之后，中药有效成分小檗碱、没食子酸可使抗菌药物的耐药菌株的敏感性提高百倍以上，表明中药活性成分可能存在增强耐药菌株对抗菌药物敏感性的效应，但其具体的作用机制还不清楚，需进一步探讨。综上所述，小檗碱与没食子酸在单独及联合抗菌药物对产ESBLs大肠埃希菌均具有良好的抑制效果，可作为单独及联合用药以抑制大肠耐药菌株扩散与传播的备选药物。