抗犬皮肤病主要病原菌细菌素的筛选及其生物学特性研究

孟雨晴，张 涵，徐菁岐，庄科勤，卢殿杰，董文龙

（吉林农业科技学院动物科技学院，吉林 132109）

犬细菌性皮肤病又称脓皮症，常发生在头部、面部和四肢等部位，患处皮肤常有发红、脱毛、结痂等症状，并伴有脓性疱疹、表皮增厚等现象，主要由伪中间型葡萄球菌（Staphylococcus pseudintermedius）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）等病原菌引起[1-2]。大部分宠物的细菌性皮肤病是一种人畜共患病，易在社区内传播[3]。针对宠物犬细菌性皮肤病，临床上多用抗生素进行治疗，抗生素的滥用加速了犬源多重耐药菌株的出现[4-5]。针对目前病原菌株耐药水平不断提升的情况，积极筛选新型替抗产品具有重要的意义。

细菌素是细菌在生长代谢过程中产生的有抑菌能力的多肽或前体肽，通过抑制肽聚糖合成、破坏细菌细胞壁、与核糖体或tRNA相互作用抑制蛋白质合成等方式起到抑菌效果[6]。研究表明，大多数细菌素只能作用于与细菌同种不同株的细菌以及与它同源性高的细菌[7]。本研究旨在筛选出能抗犬皮肤病主要病原菌的细菌素，并对其生物学特性进行研究，为开发新型替抗产品用于犬细菌性皮肤病的治疗奠定良好基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品来源 供试泡菜购于吉林市某市场。

1.1.2 菌株来源 标准株：金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠杆菌ATCC25922。临床分离株：金黄色葡萄球菌S4（犬源）、金黄色葡萄球菌S5（犬源）、绿脓杆菌L1（犬源）、伪中间型葡萄球菌D1（犬源）、大肠杆菌E4（犬源）、大肠杆菌E5（犬源），以上临床分离菌株均具有多重耐药性。

1.2 试验方法

1.2.1 乳酸菌的分离纯化 取适量泡菜置于MRS肉汤培养基中，37 ℃静置培养24 h。吸取0.1 mL浑浊菌液至MRS平板上，涂布均匀，37 ℃恒温培养24 h。挑取菌落形态不一的单菌落，接种于MRS平板划线纯化，直至镜检形态单一为止。将纯化后的菌株接种到MRS肉汤培养基中，37 ℃静止培养24 h，甘油保菌，-80℃冻存备用。

1.2.2 细菌素乳酸菌的初筛 将分离纯化得到的乳酸菌以1:300的接种量接入MRS肉汤培养基中，37 ℃恒温培养箱增殖培养24 h，室温下10 000 r/min离心15 min后收集上清液，使用孔径为0.22 µm的滤膜过滤，4 ℃保藏。

采用琼脂扩散法进行抑菌试验：将50 µL浓度调节至OD600 ≈0.5的指示菌金黄色葡萄球菌ATCC25923涂布在MH琼脂培养基上，用牛津杯在固体培养基上打孔（孔径≈8 mm），无菌发酵上清液作为试验组（每孔加入200 µL），无菌MRS肉汤培养基作为对照组（每孔加入200 µL），静止1 h后，37 ℃恒温箱中培养24 h后测量抑菌圈直径。

1.2.3 酸性物质抑菌活性排除试验和过氧化氢排除试验 为排除过氧化氢对LP-3发酵上清液抗菌活性的干扰，取1 mL发酵上清液，用乳酸、氢氧化钠将其pH调至过氧化氢酶的最适pH（pH=7.0），以最终浓度为0.1 mg/mL的量加入过氧化氢酶，置于37 ℃恒温水浴锅中水浴2 h，再将其pH调至初始状态，以未进行过氧化氢酶处理的上清液为对照组。以金黄色葡萄球菌ATCC25923为指示菌，采用琼脂扩散法对其抗菌活性进行检测。

为排除有机酸对LP-3发酵上清液抗菌活性的干扰，取5 mL发酵上清液，用乳酸、氢氧化钠调节其pH至5.0，以无菌MRS液体培养基（调节pH至5.0）为对照组。以金黄色葡萄球菌ATCC25923为指示菌，采用琼脂扩散法对其抗菌活性进行检测。

1.2.4 16S rRNA基因序列测定 用基因组试剂盒提取DNA，PCR扩增引物为细菌16S rRNA通用引物，引物序列为：

16S rRNA-F：5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，

16S rRNA-R：5'-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3'。

16S rRNA PCR产物通过1 %琼脂糖凝胶电泳进行检测，其切胶纯化产物送往生工生物工程（长春）股份有限公司测序。根据测序结果的16S rRNA序列与NCBI数据库进行同源比对[8]。

1.2.5 LP-3分泌细菌素的生物学特性测定 （1）酶对细菌素的影响：菌株发酵上清液的pH调至胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的最适pH（分别为7.4、7.4、6.0、2.0），加入1.0 mg/mL的酶37 ℃恒温水浴4 h，沸水5 min使各酶的活性丧失，再将pH调回至5.0进行抑菌试验，以未处理发酵液作对照[9]。（2）温度对细菌素的影响：将菌株发酵上清液的pH调至5.0分为四组，分别在60、80、100 ℃条件下水浴30 min以及121 ℃条件下水浴15 min，同时以未经温度处理的菌株上清液作为对照组，采用琼脂扩散法进行抑菌试验[10]。（3）pH对细菌素的影响：用1 mol/L 氢氧化钠和1 mol/L乳酸将菌株发酵上清液的pH调至4.0、6.0、7.0、9.0静止1 h，再将其调回初始pH，采用琼脂扩散法进行抑菌试验。（4）抑菌谱的测定：取-80 ℃所储存指示菌（8株）复苏活化，接种到适宜液体培养基，于37 ℃恒温培养24 h，浓度调至OD600 ≈0.5，采用琼脂扩散法进行抑菌试验，记录抑菌圈直径，以期确定菌株的抑菌谱。

以上所有抑菌试验均重复3次，抑菌圈测量3次，结果取平均值。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的分离及其细菌素的初筛

从泡菜中分离出三种乳酸菌，通过抑菌试验筛选出一株乳酸菌（LP-3）的无菌发酵上清液对犬细菌性皮肤病的主要病原菌具有抑菌作用。LP-3在MRS琼脂培养基上培养24 h后形成白色突起小型菌落，菌落边缘整齐，表面光滑，不透明，见图1。通过对菌株LP-3进行革兰氏染色发现，该菌株为革兰氏阳性，菌体呈杆状，无芽孢，见图2。

图1 LP-3菌落形态

图2 LP-3的革兰氏染色镜检图（1 000×）

2.2 细菌素的酸性物质排除试验和过氧化氢排除试验

经试验测定发现，当pH=5.0时，菌株发酵上清液对指示菌金黄色葡萄球菌ATCC25923抑菌效果良好；用乳酸调节与发酵上清液pH相同的MRS肉汤，抑制金黄色葡萄球菌ATCC25923生长繁殖的效果不明显。用过氧化氢酶处理后的上清液与对照组抑制效果相同。试验结果表明，LP-3发酵上清液对指示菌所表现的抑菌作用，不是乳酸和过氧化氢作用的结果。

2.3 16S rRNA测序结果

用细菌16S rRNA的通用引物对此菌进行DNA扩增，获得大小为1 474 bp左右的片段，见图3，经测序后分析比对，显示LP-3与平房乳杆菌（Lactiplantibacillus pingfangensis）的同源性为97.98%。

图3 16S rRNA基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳

2.4 细菌素稳定性的测定

由表1可知，LP-3所产细菌素具有良好的热稳定性，随温度的升高细菌素对指示菌的抑菌能力虽逐渐降低，但对指示菌仍有较强的抑菌活性。在pH＝4时，细菌素对指示菌均具有抑菌活性，随pH的升高对指示菌的抑菌能力逐渐降低，表明细菌素在酸性环境中活性较强。LP-3的发酵上清液对蛋白酶K敏感，而细菌素为一类有抑菌能力的多肽或前体肽，说明LP-3发酵液中的抑菌成分是一种细菌素。

表1 温度、pH、蛋白酶对细菌素活性的影响

2.5 抑菌谱

由表2可知，LP-3细菌素对犬皮肤病主要病原菌（金黄色葡萄球菌、伪中间型葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌）均有不同程度的抗菌作用。LP-3细菌素对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的标准株、犬皮肤病临床分离株的抑菌效果最好，抑菌圈直径≥30 mm。

表2 细菌素的抑菌谱

3 讨 论

犬细菌性皮肤病的主要病原菌为金黄色葡萄球菌、伪中间葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌，此类致病菌在宠物源致病菌中耐药水平不断提升，给犬细菌性皮肤病的治疗造成极大的困难。Chai等[11]从宠物及宠物主人身上分离出的金黄色葡萄球菌，其中39.4%的金黄色葡萄球菌表现出多重耐药的趋势，对青霉素的耐药率高达72.7%，对其他抗生素也表现出不同程度的耐药。施永超[12]从患脓皮症的犬中分离出18株伪中间型葡萄球菌进行药物敏感性试验与耐药基因携带情况检测发现，其中有55 %的分离株对青霉素高度耐药，其次为四环素类与大环内脂类药物，耐药率均在30 %以上，18株伪中间型葡萄球菌均携带耐药基因，其中有10株分离株含有aacAaphD。何玉菲[13]分离出的伪中间葡萄球菌对氨苄西林和罗红霉素的耐药性较高，可达65.57 %和65.30%。Dégi等[14]在犬浅层表皮分离出58株绿脓杆菌，其中有31株对头孢他啶耐药，有30株对氨曲南耐药。致病性大肠杆菌可通过呼吸道和消化道在狗群中传播，造成犬大肠杆菌病。患病的犬粪便常为稀便，会污染肛门、尾巴及后腿部位[15]。临床上多用抗生素治疗犬细菌性皮肤病，犬源性致病菌的耐药性逐年提升，为此寻找抗生素的替代品刻不容缓。

乳酸菌是一种普遍认为安全的常见微生物，容易获得且易于分离纯化。乳酸菌所产细菌素具有良好的热稳定性和对酸、盐、酶的耐受性[16]。乳酸菌细菌素还具有高效、广谱、安全等优点，能有效抑制致病菌和腐败菌[17]。目前国内外对细菌素的研究尚处于初级阶段，对宠物的致病菌进行细菌素抑菌试验本试验尚属首次。本研究从吉林省的自制泡菜中分离出一株能产细菌素的平房乳杆菌（LP-3），研究发现LP-3抑菌谱较广，对犬皮肤病主要病原菌（金黄色葡萄球菌、伪中间型葡萄球菌、绿脓杆菌）均有不同程度的抗菌作用。LP-3的抑菌物质在酸性环境中活性较强，随pH的升高对指示菌的抑菌能力逐渐降低，这与任世英等[18]的研究结果相似，说明在高pH值下抑菌活性丢失，可能是由于pH变化会使抑菌物质构象发生变化，从而引起抑菌活性降低甚至消失；本研究中LP-3的抑菌物质，与张君超等[19]对植物乳杆菌的研究结果相似，可见其乳酸菌所产细菌素在蛋白酶K等作用后水解失去全部活性，表明其具有蛋白质特性。根据排酸、排过氧化氢、蛋白酶实验LP-3发酵上清除了酸和过氧化氢，还有其它抑菌物质，并且具有蛋白特性，因此本研究中的抑菌物质初步判定为细菌素。菌株LP-3丰富了产细菌素菌株资源，为研究防治犬细菌性皮肤病的新型药物奠定基础，并有着广阔的应用前景。