干预肾素-血管紧张素-醛固酮系统不同环节对肝纤维化大鼠肿瘤坏死因子-α的影响

2023-05-09焦占江周杰

医学美学美容 2023年5期

焦占江周杰

【摘要】目的探究干預RAAS系统的不同环节对大鼠肝组织中肿瘤坏死因子-α的影响。方法选取50只SD大鼠，随机分为对照组、模型组以及3个治疗组（卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组），每组10只。对照组腹壁皮下注射橄榄油，其余组别的大鼠给予40% CCL4腹壁皮下注射；第2天开始，3个治疗组分别给予卡托普利60 mg/kg、氯沙坦10 mg/kg、螺内酯100 mg/kg治疗，模型组与对照组给予等量的生理盐水，1次/d，第8周处死，取材后，通过Real Time-PCR检测大鼠肝组织肿瘤坏死因子-αmRNA表达；病理染色，观察大鼠肝组织的病理学改变。结果 3个治疗组的肝纤维面积比较，差异有统计学意义（P<0.05）；3个治疗组大鼠的肝纤维面积与模型组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；对照组、3个治疗组的大鼠肝纤维面积均低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）；3个治疗组肝组织中TNF-α mRNA的表达比较，差异无统计学意义（P>0.05）；3个治疗组肝脏组织中TNF-α mRNA的表达低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）；模型组、3个治疗组肝脏组织TNF-α mRNA的表达高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论干预RAAS系统不同环节均可抑制肝纤维化形成，可能与抑制肿瘤坏死因子-α的表达有关。

【关键词】RAAS系统；肝纤维化；肿瘤坏死因子-α

中图分类号：R575 文献标识码：A 文章编号：1004-4949（2023）05-0028-04

Expression of Tumour Necrosis Factor-α in Hepatic Fibrosis of Rats After Local Blockage of Renin-angiptensin-aldosterone System at Different Links

JIAO Zhan-jiang1， ZHOU Jie2

（1.Department of General Surgery， the Second Peoples Hospital of Liaocheng， Liaocheng 252000， Shandong， China； 2.Department of Hepatobiliary Surgery， the Southern Hospital， the Southern Medical College， Guangzhou 510515， Guangdong， China）

【Abstract】Objective To observe the effects on the expression of tumour necrosis factor-α in hepatic fibrosis of rats after intervention of the renin-angiotensin-aldosterone system at different links. Methods Fifty SD rats were randomly divided into control group， model group and three treatment groups （captopril group， losartan group and spironolactone group）， with 10 rats in each group. The rats in the control group were subcutaneously injected with olive oil， and the rats in the other groups were subcutaneously injected with 40% CCL4. From the second day， the three treatment groups were treated with captopril 60 mg/kg， losartan 10 mg/kg and spironolactone 100 mg/kg， respectively， and the model group and the control group were given the same amount of normal saline， once a day. The rats were sacrificed at the 8th week， and the expression of tumor necrosis factor-α mRNA in rat liver tissue was detected by RealTime-PCR. Pathological staining was used to observe the pathological changes of rat liver tissue. Results There was significant difference in liver fiber area among the three treatment groups （P<0.05）. There were significant differences in liver fiber area between the three treatment groups and the model group （P<0.05）. The liver fiber area of rats in the control group and the three treatment groups was lower than that in the model group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. There was no significant difference in the expression of TNF-α mRNA in liver tissue among the three treatment groups （P>0.05）. The expression of TNF-α mRNA in liver tissue of the three treatment groups was lower than that of the model group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The expression of TNF-α mRNA in the liver tissue of the model group and the three treatment groups was higher than that of the control group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion Intervention in different links of RAAS system can inhibit the formation of hepatic fibrosis， which may be related to the inhibition of tumor necrosis factor-α expression.

【Key words】Renin-angiotensin-aldosterone system； Hepatic fibrosis； Tumour necrosis factor-α

临床中自身免疫性疾病、脂肪肝、病毒感染、过度饮酒等因素均可导致肝纤维化的发生。肝纤维化（hepatic fibrosis）是人体肝脏对各种慢性损伤的病理性修复反应，其能够进一步导致纤维结缔组织异常增生，肝纤维化处于早期时，是可以逆转的，但是如果在肝纤维化早期时未及时加以阻断，会进一步发展可引起肝小叶结构紊乱，肝细胞结节性再生，发展为肝硬化，这时候的病理改变不可逆，会严重危害到患者的生命安全[1，2]。TNF-α在肝纤维化的发生、发展中起着重要的作用[3]。RAAS为一内分泌系统，具有广泛的生物学效应。肝纤维化的发展与RAAS系统密切相关[4-6]。尽管RAAS系统在肝病中的机制还没有完全阐明，但这提示RAAS可能为抗肝纤维化治疗的潜在靶点。基于此，本研究通过干预RAAS不同环节对大鼠肝纤维化肿瘤坏死因子-α的影响，旨在为抗肝纤维化的治疗提供一定的实验依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料选取6周SD大鼠50只，体重180～220 g，购买于福建医科大学动物实验中心，动物合格证编号为：SCXK（闽）2012-0001，常温常湿环境饲养。二抗购自Cellsignaling公司，TNF-α抗体、β-actin抗体购自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1动物的分组、模型的制备及用药 50只大鼠按随机区组设计分为模型组、对照组以及3个治疗组，各10只。对照组大鼠皮下注射橄榄油，3 ml/kg；其余大鼠在腹壁皮下注射40%CCl4，3 ml/kg，首剂量要加倍，建立大鼠肝纤维化模型，每3 d注射1次；第2天起，3个治疗组开始用药，分别予以螺内酯100 mg/kg、氯沙坦10 mg/kg、卡托普利60 mg/kg，用10 ml的生理盐水稀释后灌胃；对照组和模型组给予10 ml生理盐水1次/d灌胃，在第8周时，处死所有大鼠，取材备测。

1.3 观察指标 ①一般情况：比如饮食、活动、体重、精神等；②大鼠肝组织病理学观察：大鼠的肝组织固定，包埋，切片，进行HE染色和Masson染色；大鼠肝组织Masson染色后，每张病理切片选择肝脏组织四周及中央区域，并选取胶原纤维含量最多的视野，用计算机图像分析系统，记录着色的面积和总面积，在100倍镜下测定肝脏组织胶原纤维面积百分比，计算方法为：胶原纤维面积/肝组织面积×100%；采用肝纖维化半定量计分系统（semi-quantitative scoring，SSS）进行评分。

1.4 Realtime PCR的检测 100 mg肝组织标本，用TRIzol法抽提组织总RNA。将总RNA进行逆转录获得cDNA。引物由Invitrogen公司合成。序列是：TNF-α（148 bp）上游：5CTGGCCAATGGCATGGATCTCAAA3；下游：5ATGAAATGGCAAATCGGCTGACGG3；Real-Time PCR反应：根据引物序列设置扩增程序，94 ℃ 5 min、94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s、72 ℃ 10 min；共40个循环。在200 μl的灭菌离心管中加入（25 μl反应体系）：模板cDNA 0.5 μl ；上游引物0.5 μl；下游引物0.5 μl；SYBR green supermix，12.5 μl；去离子水11 μl，将离心管放入PCR扩增仪，按扩增程序进行PCR扩增；数据采用仪器ABI Prism 7300 SDS Software的软件分析，基因的表达量用2-△△Ct法计算。

1.5 统计学方法采用SPSS 11.0统计软件进行数据分析，计量资料以（x-±s）表示，组间比较行F检验；计数资料以[n（%）]表示，组间比较行χ2检验；以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般状态观察各组大鼠均无死亡，模型组的大鼠精神不振，活动减少，对外界的反应变迟钝，进食和饮水变的减少，大鼠体重下降明显；对照组各项活动均正常，体重增加；3个治疗组的大鼠精神、活动、反应、饮食、体重与模型组比较，均比较好。

2.2 各组肝组织病理变化比较肝组织Masson染色，对照组大鼠肝组织中，可以看到胶原纤维只是在血管周围有少量的表达，模型组大鼠肝组织中纤维有明显的增生，形成了纤维间隔，有的区域形成了假小叶；3个治疗组大鼠肝组织中胶原纤维减少，纤维间隔以及假小叶减少。HE染色见对照组大鼠的肝组织中，肝细胞以肝脏的中央静脉为中心，向四周呈放射状排列，且肝脏组织结构完整；模型组大鼠肝组织中，肝细胞排列紊乱，有的肝细胞甚至呈脂肪变性，汇管区增大，在部分肝组织中，汇管区和肝小叶内还能够见到浸润的淋巴细胞，甚至可以见到肝脏组织中有假小叶；3个治疗组大鼠肝组织中可以见到肝细胞坏死减少，空泡变性减少。

2.3 各组大鼠肝纤维化半定量评分比较 3个治疗组大鼠肝纤维化评分低于模型组（P =0.000、0.000、0.000）；3个治疗组间大鼠肝纤维化评分相比，差异无统计学意义（P=1.000、0.980）；对照组、3个治疗组大鼠肝纤维化评分低于模型组（P=0.000、0.000、0.000），见表1。

2.4 各组大鼠肝纤维面积比较 3个治疗组的肝纤维面积比较，差异无统计学意义（P =0.779、0.422）；对照组、3个治疗组肝纤维面积均低于模型组（P=0.000），见表2。

2.5 各组大鼠肝脏TNF-α表达情况比较 RealtimePCR结果分析显示，3个治疗组间TNF-αmRNA的表达比较，差异无统计学意义（P=0.663、0.082）；3个治疗组TNF-αmRNA表达均低于模型组（P=0.000）；模型组、3个治疗组TNF-αmRNA的表达高于对照组（P=0.000），见表3。

3 讨论

肝纤维化是人体肝脏组织对损伤的愈合修复反应[7]。研究表明[10]，各种各样的因素导致慢性肝病在发展过程伴有肝纤维化的发生，肝纤维化早期的时候如不能得到有效控制，可能会发展为肝硬化，肝癌[8，9]。研究表明[11，12]，大部分肝纤维化患者治疗后肝纤维化可逆转至正常。肝脏纤维化是肝脏中的细胞外基质增生和降解平衡被打破，从而造成肝脏内纤维结缔组织异常沉积、肝脏结构和功能改变的结果。以往认为RAAS是人体一个内分泌系统，近年来研究发现[13]，它与肝纤维化的形成有密切关系，它的激活是肝纤维化形成的重要病理机制。TNF-α是一种与内毒素无关的、可引起肿瘤出血坏死的活性分子。TNF-α在肝纤维化的产生及发展中起着重要的作用，研究发现[14]，TNF-α刺激肝脏星状细胞后，可让它的形态学和功能学发生相关的改变，可让它转化为成为纤维细胞，储脂能力丧失，并且表达α-平滑肌肌动蛋白，随着时间的延长，其激活效应反而增加。在正常情况下，肝组织中不表达或微量表达TNF-α，当受到损伤因素刺激时，大量的TNF-α被释放出来，参与肝损伤过程，促进肝纤维化的发生、发展[15]。研究表明[16]，肝组织局部炎症反应时，TNF-α等炎症因子大量释放，促进肝星状细胞的增殖、分化，使HA、PCⅢ、Ⅳ-C、LN等细胞外基质合成增多，间接引起纤维化形成。有研究表明[17]，有一部分中药提取物，可能有抗肝纤维化作用，其作用机制可能与降低血清中TNF-α等细胞因子水平有关。

本研究结果显示，采用Real time PCR对大鼠的肝脏组织TNF-αmRNA进行了检测，发现3个治疗组大鼠肝组织中TNF-αmRNA的表达情况比较，差异无统计学意义（P均>0.05）；3个治疗组大鼠肝组织中的TNF-αmRNA表达却低于模型组，差异有显著意义（P<0.01）；模型组、3个治疗组大鼠肝组织中的TNF-αmRNA表达高于对照组，差异有显著意义（P<0.01），说明干预于RAAS的不同环节均能够减弱大鼠肝纤维化中TNF-αmRNA的表达。

此外，本研究通过CCL4建立的大鼠肝纤维化模型，病理学结果显示，3个治疗组大鼠较模型组大鼠的肝纤维化程度减轻，提示干预RAAS不同环节对大鼠肝纤维化具有比较好的抑制作用。Realtime PCR结果显示，模型组大鼠肝脏组织TNF-α的表达增强，但3个治疗组肝脏组织TNF-α的表达减弱。

综上所述，干预RAAS不同的环节对大鼠肝纤维化的作用机制可能和TNF-α的表达减弱有关系。

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