基于SKP-SCs 来源胞外囊泡构建的神经移植物桥接周围神经缺损的生物安全性评价*

喻妙梅，王 伟，沈筠恬，沈 宓

（1 南通大学教育部·江苏省神经再生重点实验室，江苏 226001；2 南通大学医学院；3 南通大学附属医院病理科）

周围神经损伤为临床常见疾病,当神经缺损距离较大时,受神经吻合口处张力的限制无法进行简单的端对端缝合,开发有效的神经替代物和修复方法以治疗神经缺损成为近年来的研究热点。神经移植物构成神经再生微环境的重要成分,通过筛选神经支架和优化内部结构、种子细胞和生长因子,可以使神经移植物发挥最大化促神经再生作用。皮肤源性前体细胞（SKPs）是一种从胚胎及成年真皮中提取的来自神经嵴的多能干细胞[1],能分化成神经元、成髓鞘施万细胞[2-4]、中胚层谱系的成骨细胞[5]、造血细胞、平滑肌细胞等[6-8]。细胞外囊泡（Evs）是由活细胞分泌的直径30～1 000 nm 的含膜囊泡,含有来自母体细胞多种特异性生物成分,可以在细胞间进行物质和信息传递,从而改变受体细胞的功能[9]。

本课题组从新生SD 大鼠背部皮肤中分离纯化SKPs 后,将其定向分化为施万细胞（SKP-SCs）,体外扩培细胞后获取SKP-SC-EVs,发现SKP-SC-EVs能够促进神经元生长[10-11]。基质胶（Matrigel）是可溶性基底膜细胞外基质蛋白,采用Matrigel 装载可维持EVs 在导管中的稳定及可持续性释放,有利于促进神经损伤后的再生和功能恢复。Matrigel 装载SKP-SC-EVs 至硅胶管中构建神经移植物能促进大鼠坐骨神经损伤的修复,具有潜在临床应用前景[12]。神经移植物需要在较长一段时间内与人体接触,严格评估其生物安全性极为重要。本研究旨在通过血液学检查、病理组织学分析全面检测含SKP-SCEVs 神经移植物的生物安全性,使临床风险降到最小限度。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器 Matrigel 生长因子减少型（GFR）基质胶（货号356231）,硅胶管2 mm×3 mm（货号6-586-05）,exoEasy Maxi Kit 试剂盒（货号76064）,纳米颗粒跟踪分析NTA（German Metrix 公司）全自动组织处理机ASP300S 型（LEICA）;病理组织漂烘仪PH60 型（派斯杰医疗）;组织包埋机BM450A 型（派斯杰医疗）,轮转式切片机RM2235 型（LEICA）,全自动染色封片一体机Tissue-Tek Prisma Film-JC2型（SAKURA）,研究级显微镜ECLIPSE Ni 型（Nikon）。

1.2 神经移植物制备 取新生SD 大鼠背部皮肤,分离培养SKPs,并诱导分化成SKP-SCs。大量扩增培养后收集上清,采用exoEasy Maxi Kit 试剂盒提取EVs,NTA 粒径分析EVs 大小分布及浓度。将基质胶与2×1010粒SKP-SC-EVs（EV-NG 组）注射于12 mm 硅胶管中,37 ℃孵育30 min,凝固后形成神经移植物备用（图1）。采用Matrigel 基质胶+PBS 为对照（NG 组）。

图1 基于SKP-SC-EVs 构建的神经移植物

1.3 动物实验分组及处理 SPF 级雄性SD 大鼠20只,8 周龄,220～250 g,由南通大学实验动物中心提供［实验动物合格证编号：202130154,实验动物生产许可证编号：SYXK（苏）2017-0046］。随机分为4 组：假手术组,自体移植组,NG 组,EV-NG 组,每组5只。假手术组：右侧坐骨神经暴露后即缝合伤口。右侧坐骨神经暴露后,剪去一段神经回缩后达10 mm缺损,自体移植组将剪下的神经颠倒180 度桥接于缺损处近、远残端;NG 组采用NG 桥接缺损处缝合;EV-NG 组将EV-NG 与两断端的神经外膜缝合,并使两断端套接入导管。动物手术在南通大学实验动物中心内操作,术后各组给予基础饲料单笼喂养,自由饮食,观察大鼠饮食、活动情况。

1.4 主要脏器组织病理学观察 术后12 周处死大鼠,对心脏、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏、脑等各主要脏器的病理改变进行大体观察。将组织标本浸入4%多聚甲醛固定,全自动组织处理机脱水处理,石蜡包埋制片,常规苏木精-伊红（HE）染色后显微镜下观察。

1.5 血液指标测定 术后12 周从大鼠心脏采集血液,使用全自动血液分析仪进行血常规检测（白细胞、红细胞、血小板和血红蛋白等）,全自动生化分析仪测定转氨酶、白蛋白、尿素氮和碱性磷酸酶等。

1.6 统计学处理 应用SPSS 23.0 统计学软件处理分析数据。符合正态分布的计量资料以±s表示,组间差异性比较采用t 检验,P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠术后损伤侧后肢运动状态观察 术后各组大鼠饮食正常,均未出现死亡。术后假手术组大鼠术侧后肢运动正常,而自体移植组、NG 组和EV-NG 组大鼠均出现术侧足不能弯屈,趾甲缺失,站立不稳等明显神经损伤表现。术后12 周3 个桥接组大鼠均能灵活行走,但损伤侧后肢步态存在一定差异,自体移植组和EV-NG 组步态较为协调,NG组足趾蜷缩、外翻较为明显,行走时足趾占地面积更大。此外,3 个桥接组大鼠均出现不同程度咬足行为,EV-NG 大鼠术侧足趾破损较轻,行走动作基本协调,与假手术组较为接近。

2.2 各组大鼠脏器组织病理学观察 术后12 周各组主要脏器组织颜色和大小均无显著改变,未见变性出血及坏死等。组织切片病理HE 染色结果见图2。心脏：心肌细胞呈短柱状,形态正常,细胞连接处可见特征性闰盘。肝脏：肝小叶与结缔组织构成门管区,肝细胞以中央静脉为中心,周围肝细胞索放射状排列成网,大小正常。脾脏：脾结构完整,白髓和红髓相间,脾窦内见血细胞,结构形态清晰。肺脏：肺泡形态结构正常,未见炎性反应及淤血。肾脏：肾小管、集合管形态结构正常。脑：脑组织形态结构正常,可见神经元及胶质细胞形态正常。

图2 各组大鼠主要脏器病理切片HE 染色观察

2.3 各组大鼠血常规及主要生化指标分析 术后12 周各组大鼠血常规及主要生化指标均在正常参考范围内,EV-NG 组与假手术组和NG 组比较,各项指标的差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1～2。

表2 各组大鼠血生化指标分析

3 讨 论

对植入人体的医用材料生物性能要求极高,在体内应保持相对稳定,不发生排斥反应。以往研究显示,硅胶管和Matrigel 具有良好的亲水性和生物相容性。硅胶管来源与自然生物成分相似,易获取,因而广泛用于医用材料。Matrigel 通过增强的渗透效应和滞留效应实现体内缓慢释放,Matrigel 共培养细胞可明显改善周围神经损伤模型[13]。本实验中我们将以往研究中发现具有良好促神经生长作用的SKPSC-EVs 通过Matrigel 装载注入硅胶管中,制成神经移植物,桥接修复大鼠10 mm 坐骨神经缺损,检测含EVs 神经移植物体内组织反应、血常规及主要生化指标,验证该移植物的生物安全性。

SKPs 作为一种成体干细胞容易获得,可大量扩增培养,体外诱导分化成施万细胞（SCs）,具有一定成髓鞘能力,能显著促进周围神经再生。然而,种子细胞治疗需考虑免疫排斥、微循环阻塞等风险。目前在再生医学中,基于EVs 的无细胞治疗方法被视为纳米医学中最具前景的候选者之一[14]。EVs 具有良好的生物相容性、生物可降解性、低毒性和非免疫原性等优点,可大大降低植入细胞带来的风险[15]。EVs内含有来自母体细胞特异性脂质、蛋白质、mRNA、miRNA 和DNA 等多种生物成分,在多种脏器损伤中发挥促进修复再生的作用[16-17]。

本研究结果显示,术后12 周EV-NG 组大鼠术侧肢体运动状态接近假手术组,足趾破损较轻,弯屈障碍得以恢复;各组大鼠心、肝、脾、肺、肾、脑等脏器均无病理性改变,提示EV-NG 组大鼠主要组织器官未发生明显急慢性病理损伤变化;各组大鼠血常规及主要生化指标均在正常参考范围内,EV-NG 组与假手术组的差异均无统计学意义（P＞0.05）。因此,Matrigel 装载SKP-SCs 来源的EVs 注射至硅胶管中制备成的神经移植物生物安全性较高,为临床治疗周围神经缺损提供安全性依据。