初始酸碱度对龙眼酒酿造过程中有机酸变化规律的研究

邓红梅，温兆毅，柳镜炬，王 春

（广东石油化工学院生物与食品工程学院，广东省岭南特色果蔬加工及应用工程技术研究中心，广东茂名 525000）

龙眼是茂名等岒南地区特色的水果之一，其果肉营养丰富，有滋补强体、补益心脾、养血安神、益智宁心等多种功效。龙眼果肉含糖高达20 %，风味好，具有很高的营养价值，因此龙眼是酿造果酒的优质原料[1]。以龙眼为原料，低温发酵，陈酿而成的发酵果酒，具有益气补血、安神定志、降脂护心、延缓衰老等保健功能[2]。龙眼果酒中，富含维生素、有机酸及含氮物质，其中有机酸具有抑菌、抗病毒、增加冠脉流量、抑制脑组织脂质过氧化物生成、消炎和抗癌等作用，是果酒中主要的呈味物质。有机酸含量高低与果酒的品质和药用价值有着极其密切的关系[3-7]。本课题组之前研究了不同初始糖度条件下，龙眼酒发酵过程中有机酸成分和含量的变化规律[6]，本实验利用高效液相色谱法分析不同初始酸碱度对龙眼酒发酵过程中有机酸动态变化规律的影响，找到口感最佳的发酵条件，为龙眼酒酿造过程中有机酸的调控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

原料：龙眼品种为石硖，购于茂名农贸市场；高活性干酵母，安琪酵母股分有限公司。

试剂及耗材：蔗糖、果胶酶、偏重亚硫酸钾为食品级，磷酸二氢钾、草酸、酒石酸、苹果酸、α-酮戊二酸、柠檬酸、乳酸、琥珀酸、草乙酸为标准品，甲醇为色谱纯。

仪器设备：LC20AT高效液相色谱仪，日本岛津公司；BSP-250 恒温培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；BCD-246WTM(E) 美的冰箱，合肥美的电冰箱有限公司；HH-4 数显恒温水浴锅、80-2电动离心机，常州澳华仪器有限公司；RE-3000旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；JA1003 电子分析天平，上海上天精密仪器有限公司；WZ 系列手持折光糖度计，上海聚亮光学仪器有限公司；RHWN-25OeATC手持折光酒度计，漳州市新奥光电仪器有限公司；UV5500PC 紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 龙眼酒酿造工艺

龙眼→分选→清洗→去壳去核→搅碎→加果胶酶酶解→过滤除渣→成分调节→加活化后的果酒酵母→前发酵→澄清、换罐→后发酵→成品→检测

1.2.2 操作要点

（1）挑选新鲜完整的龙眼去壳去核获得石硖龙眼2500 g，加入偏重亚硫酸钾1.25 g，防止果肉氧化。

（2）搅碎时按果肉∶超纯水的体积比=3∶1 的比例加入超纯水800 mL，按果肉∶柠檬酸的质量比=5000∶1 的比例加入柠檬酸0.5 g，按果肉∶果胶酶的质量比=1250∶1 的比例加入果胶酶2.0 g 处理3 h，搅碎完成后，将果汁过滤装入5 L玻璃发酵罐中。

（3）添加柠檬酸调整pH 值分别为3.0、3.3、3.6、3.9、4.2 五个初始酸碱度（pH）梯度，进行二组平行实验。按果肉∶酵母的质量比=50000∶7 的比例加入活化酵母菌0.35 g，22%蔗糖，在20 ℃下进行发酵。7 d后过滤除渣、换罐、封闭进行后发酵。

（4）在发酵前取果汁，第7 天龙眼酒的主发酵基本完成时取酒样；第14 天、第21 天、第28 天以及第35 天龙眼酒发酵完成时取酒样，研究8 种有机酸在发酵过程中的含量变化。

1.2.3 龙眼酒中有机酸含量的测定

样品处理及色谱条件均与文献[6]相同。

2 结果与分析

2.1 有机酸标准曲线及色谱图

以不同浓度的有机酸为横坐标，以峰面积为纵坐标，做标准曲线，得出线性回归方程和相关系数R2，如表1所示。

由表1 可知，8 种有机酸标准曲线相关系数R2＞0.999，表明高效液相色谱法（HPLC）可以用于果酒中有机酸的测定，测定结果准确度高。

表1 有机酸标准曲线回归方程和相关系数

2.2 不同初始酸碱度（pH）龙眼酒发酵过程中8 种有机酸含量的变化

以有机酸含量为纵坐标，发酵时间（果汁定为0）为横坐标，用Origin Pro 8 软件做出龙眼酒发酵过程有机酸含量变化。

从图1—图5 可知，在不同初始酸碱度条件下，龙眼酒发酵过程中8 种有机酸的变化有相似性。在主发酵期间（前7 d），酒石酸、苹果酸含量明显下降，乳酸、柠檬酸、琥珀酸含量明显增加；发酵28～35 d，草酸、酒石酸、苹果酸、α-酮戊二酸最终含量均比果汁中含量低；草酸、α-酮戊二酸含量变化不大，一直保持缓慢下降趋势，草乙酸、乳酸、柠檬酸和琥珀酸的最终含量比果汁中含量有所提高。

图1 初始pH 3.0发酵过程有机酸含量变化

图2 初始pH 3.3发酵过程有机酸含量变化

图3 初始pH 3.6发酵过程有机酸含量变化

图4 初始pH 3.9发酵过程有机酸含量变化

图5 初始pH 4.2发酵过程有机酸含量变化

经过35 d 的发酵与陈酿，不同初始酸碱度酿造的龙眼果酒中8 种有机酸与龙眼果汁中的有机酸比较可得出变化规律，见表2。

果汁和果酒中的有机酸是非常重要的一类化合物，有机酸的含量以及分布显示了果汁和果酒的感官质量(包括风味、颜色和香气)、稳定性和微生物活动状况等[8]。有机酸在不同的果酒中，甚至是同种水果不同发酵工艺酿制的果酒，种类及含量均存在较大差异，导致不同果酒风味各异[6，7-9，10]。发酵过程酵母的代谢包括酒精发酵、乙酸或苹果酸-乳酸发酵。酵母代谢离不开酶，酶活性又受pH 值的影响，pH 值过高或者过低都会使酶活性降低或失活，只有在最适pH 值，酶活性才能最高。酶活性高低会直接影响产物（包括有机酸）含量变化。

由表2 可知，经过35 d 发酵与陈酿后，不同初始酸碱度对8 种有机酸的影响有差异。草酸在整个发酵过程含量（相对果汁）都是下降的，不同pH间含量变化不大，即受初始酸碱度的影响很小；初始酸碱度pH≤3.9 时酒石酸在各初始酸碱度间含量下降幅度变化不大，在21 %～23 %之间，当pH4.2时，降低幅度达41.07%，说明龙眼酒中可能存在酒石酸的解离平衡，初始酸碱度增加，有利于酒石酸解离，酒石酸根离子增加，与其中的阳离子结合形成酒石酸盐；柠檬酸含量随着初始酸碱度的增加而减少；乳酸和苹果酸的含量随着初始酸碱度的增加而增加。主要原因是由于不同pH 值对代谢途径中酶活性的影响不同。

本实验研究了pH 值为3.0、3.3、3.6、3.9、4.2 五个初始酸碱度梯度，在20 ℃下低温发酵酿造龙眼酒，通过对龙眼酒色泽、香气、酒体、风味进行评价，一致认为初始pH3.6～3.9 发酵酿制的龙眼酒品质最佳。

2.3 pH3.9时龙眼酒有机酸含量动态变化规律

8种有机酸标准色谱图见图6，pH 3.9时龙眼酒发酵过程中8种有机酸的色谱图见图7—图11。

图6 标准溶液色谱图

图7 pH 3.9发酵第7天色谱图

图8 pH 3.9发酵第14天色谱图

图9 pH 3.9发酵第21天色谱图

图10 pH 3.9发酵第28天色谱图

图11 pH 3.9发酵第35天色谱图

通过对各有机酸峰面积计算得到初始酸碱度pH3.9时石峡龙眼酒有机酸含量变化，见表3。

由表3 可知，不同发酵时期8 种有机酸的总量均比原果汁高，发酵前7 d有机酸变化最明显，其余时期基本上是平稳变化。表明发酵过程中有机酸的增加与发酵同步，这对果酒的风味及维持酸性环境抑制有害细菌达到长久储存的目的是有益的，与之前研究不同初始糖度对龙眼酒酿造过程中有机酸变化规律相似[6]。在整个发酵与陈酿过程中，草酸、酒石酸和苹果酸含量均比原果汁下降，草酸、酒石酸含量变化主要是由于形成了相应的草酸盐和酒石酸盐，同时，酒石酸也能被乳酸菌降解生成乳酸和乙酸。酒石酸的含量先降后升，可能是伴随发酵产生的各种代谢物会引起发酵液中pH 变化，影响酒石酸盐的稳定性，导致酒石酸含量的变化。乳酸是龙眼汁和龙眼酒中含量最大的有机酸，在发酵过程中，乳酸处于积累的过程，与此同时，苹果酸则表现出消耗的过程，是由于发酵时一直存在着能生成乳酸的代谢途径——苹果酸-乳酸发酵[11]。草乙酸、琥珀酸和柠檬酸的含量在主发酵（7 d 前）均比原果汁明显上升，随着发酵的继续，含量变化趋于稳定。琥珀酸主要来自糖分子的发酵作用，是酒精发酵的正常发酵产物，少量来自于果汁中谷氨酸的变化，谷氨酸存在时，琥珀酸积累增多[12-13]。由于苹果酸、酒石酸含量的减少，乳酸、琥珀酸含量的增加，使龙眼酒的口感变得更加柔顺细腻、润滑和醇厚[6，14]。

表3 初始酸碱度pH 3.9时龙眼酒各时期有机酸的含量

酸类是形成酒香味的主要物质之一，酒中缺乏酸会使酒显得不柔和、不协调。酸类是形成酯类的前体物质，还可以构成其他香味成分。适量的酸在酒中能起到缓冲作用，消除口味的不协调，促进酒的甜味感。初始酸碱度pH3.9 酿制的龙眼酒中主要的有机酸是乳酸（7178.5 mg/L）、琥珀酸（2900.6 mg/L）、苹果酸（2611.7 mg/L）、柠檬酸（2365.8 mg/L），其次是酒石酸（1272.5 mg/L）和草乙酸（1125.5 mg/L），还有少量的草酸（125.1 mg/L）、α-酮戊二酸（288.4 mg/L）。乳酸是一种略带酸味的一元弱酸，能使果酒口感柔和、圆润；琥珀酸具有酸味及轻微的咸味和苦味，易溶于酒，使酒味调和，最具有味觉特征，可使酒的味道浓重，增加醇厚感[15]。

3 结论

在不同初始酸碱度条件下，龙眼酒发酵过程中8 种有机酸的变化有相似性。在发酵前7 d，酒石酸、苹果酸含量明显下降，乳酸、柠檬酸、琥珀酸含量明显增加；发酵第28～35 d，草酸、酒石酸、苹果酸、α-酮戊二酸最终含量均比果汁中低；草酸、α-酮戊二酸含量变化不大，一直保持缓慢下降趋势；草乙酸、乳酸、柠檬酸和琥珀酸的最终含量比果汁中含量高。经过35 d 发酵与陈酿后，不同的初始酸碱度对8 种有机酸的影响是有差异的。草酸在整个发酵过程含量（相对果汁）都是下降的，不同pH间含量变化不大，即受初始酸碱度的影响很小；初始酸碱度pH≤3.9 时酒石酸在各初始酸碱间含量下降幅度变化不大，但在初始酸碱度pH4.2 时，降低的含量是其他初始酸碱度的近一倍；苹果酸初始酸碱度pH≤3.6 时降低的含量相当于pH＞3.6 时的1倍；柠檬酸含量随着初始pH 的增加而减少；乳酸含量随着初始pH的增加而增加。

在pH 3.9 条件下，不同发酵时期8 种有机酸的总和均比原果汁高，其中发酵前7 d 有机酸变化最明显，其余时期基本上平稳变化。在整个发酵与陈酿过程中，草酸、酒石酸和苹果酸含量均比原果汁明显下降；草乙酸、琥珀酸和柠檬酸的含量在主发酵（7 d 前）时均比原果汁明显上升，随着发酵的继续，含量变化趋于稳定。主要的有机酸是乳酸（7178.5 mg/L）、琥珀酸（2900.6 mg/L）、苹果酸（2611.7 mg/L）、柠檬酸（2365.8 mg/L），其次是酒石酸（1272.5 mg/L）和草乙酸（1125.5 mg/L），还有少量的草酸（125.1m g/L）、α-酮戊二酸（288.4 mg/L），各种有机酸相互调和使龙眼酒风味独特。