高产酸性蛋白酶白曲霉培养条件的优化研究

曹润洁，杜成龙，何宏魁，，马金同，王 冕，袁志强，周鹏磊，马叶胜

（1.安徽瑞思威尔科技有限公司，安徽亳州 236800；2.安徽古井贡酒股份有限公司，安徽亳州 236800）

酸性蛋白酶可应用于不同工艺、不同香型白酒的生产，能在酸性环境下水解蛋白质，可以促进微生物生长及酶的形成，可形成白酒风味物质，使酒体丰满醇厚，适合在酿酒的环境中发挥作用，有改善白酒风味的作用，并能提高原酒品质[1]。

白曲霉具有蛋白酶活性强、耐酸度高、培养条件粗放等特点[2]。本研究以实验室保藏的白曲霉菌株为目标菌株，从生长条件、产酶活力的关键工艺因素进行研究分析，以提高白曲霉菌株的酸性蛋白酶活力为目的，探究高产酸性蛋白酶白曲霉实验室最佳培养条件，对其应用于酿酒生产具有指导意义[3]。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1 试验原料及耗材

试验菌株：本公司选育、保藏的白曲霉（Aspergillus albicans）菌株M047，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号是CCTCC M 2022054。

菌种保藏（斜面）培养基：麦芽粉130.0 g/L，氯霉素0.1 g/L，琼脂15.0 g/L，蒸馏水1000 mL，pH 值6.0±0.2(25 ℃下)，121 ℃灭菌20 min。

种子（平板）培养基：马铃薯浸出粉6.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，氯霉素0.1 g/L，琼脂15.0 g，蒸馏水1000 mL，pH 值5.4～5.8(25 ℃下)，115 ℃灭菌20 min。

液体培养基：1 份高粱粉，加水4 份蒸煮0.5～1 h，按淀粉酶使用说明加入淀粉酶进行液化，液化后补加55～75 ℃温水1 份，搅拌均匀，在55～75 ℃糖化0.5～1 h，稀碘液试之不显蓝色，用细纱布过滤，测量溶液的糖度并调整为8°～10°波美度，自然pH值，115 ℃灭菌20 min后使用。

三角瓶菌种培养基：250 mL 三角瓶装入20 g麸皮和20 mL 水，搅拌均匀后封口膜封口，自然pH值，121 ℃灭菌20 min。

1.1.2 试剂及耗材

磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫酸亚铁、硫酸镁、氯化钠、氢氧化钠、三氯乙酸、乳酸、甘油（均为分析纯），国药集团；琼脂（BR），国药集团；干酪素（BR），AOBOX；福林酚试剂（BR），罗恩试剂。

1.1.3 仪器设备

ME204E 型电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；一列八孔型电热恒温水浴锅，龙口市先科仪器有限公司；SX-700 型高压灭菌锅，TOMY KOGYO 公司；BSC-1300ⅡA2 型生物安全柜，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；MHP-100 智能霉菌培养箱，上海三发科学仪器有限公司；UV9000型紫外可见光分光光度计，上海元析仪器有限公司；PhS3C/0-14 型pH 计，上海仪电科学仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种活化

将本公司选育、保藏的白曲霉菌株M047 制成孢子菌悬液，进行平板涂布，置于30～32 ℃恒温培养48 h，做平板划线培养[4]。

1.2.2 平板菌种的制备

将活化后的白曲霉菌株点接于种子（平板）培养基上，置于30～32 ℃智能霉菌培养箱中，培养36～48 h，白曲霉成熟后即可使用。

1.2.3 三角瓶菌种制备

250 mL三角瓶装入20 g麸皮和20 mL水，搅拌均匀后封口膜或者棉塞进行封口，每个三角瓶物料厚度在2 cm 左右，于121 ℃灭菌30 min，灭菌后趁热将曲料摇松，冷却至40 ℃左右接种，置于30～32 ℃智能霉菌培养箱中，培养24 h 后摇瓶1 次，再培养12～24 h即可完成培养。

1.2.4 福林酚法检测菌株产酸性蛋白酶的能力

三角瓶试验种曲制备：根据单因素试验或者正交试验设计试验样本需求，将上述三角瓶菌种按照一定的接种量接入三角瓶培养基中，按照设计的培养温度和培养时间进行培养，培养过程操作参照“1.2.3三角瓶菌种制备”方法。

根据上述制备种曲的方法制备试验菌株的试验种曲，利用国标GB/T 23527—2009 福林酚法测酸性蛋白酶活力的方法测算试验菌株试验种曲的酸性蛋白酶活力值。

1.2.5 培养条件的优化

从生长条件、产酶活力的关键工艺因素进行研究分析，以提高菌株白曲霉的酸性蛋白酶活力为目的，探究高产酸性蛋白酶白曲霉最适培养条件。以麸皮为主要原料，将培养基水分、培养基pH 值、培养温度、培养时间等作为影响因素进行单因素试验，找出影响菌株生长的显著性因素并进行正交试验对其实验室培养条件进行优化。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 培养基水分的选择

培养基以麸皮为主要原料，对培养基水分设定6 个梯度进行试验，加水量分别为原料量的60%、80 %、100 %、120 %、140 %和160 %。121 ℃灭菌30 min 后，冷却至40 ℃左右，在无菌条件下接种白曲霉三角瓶菌种，置于32 ℃智能霉菌培养箱中培养48 h，检测其酸性蛋白酶活力。

由图1 可知，当加水量为60%～100%时，菌体酸性蛋白酶活力随着培养基加水量的增加而增加；当加水量为100 %～160 %时，菌体酸性蛋白酶活力随着培养基加水量的增加而减少。加水量为100%时，菌体酸性蛋白酶活力最高。

图1 培养基水分添加量对白曲霉产酸性蛋白酶活力的影响

2.1.2 培养基pH值的选择

微生物的生长需要在适宜的酸碱环境下，保持培养基水分添加量为100 %，调节培养基的pH 值为2、3、4、5、6、7，其他条件保持不变，培养完成后，检测其酸性蛋白酶活力。

从图2 可以看出，在培养基pH 值为4 时菌体酸性蛋白酶的活力最高，故选择培养基的pH值为4。

图2 培养基pH值对白曲霉产酸性蛋白酶活力的影响

2.1.3 培养温度的选择

保持培养基水分添加量为100%，调节培养基的pH 值为4，其他条件保持不变，对培养温度设定6 个梯度进行试验，温度分别为26 ℃、30 ℃、34 ℃、38 ℃、42 ℃和46 ℃，培养48 h 后，检测其酸性蛋白酶活力。

由图3 可知，菌体培养时的培养温度对菌体的酸性蛋白酶活力影响较大。当培养温度低于38 ℃时，菌体的酸性蛋白酶活力随着温度的升高呈递增趋势，当温度高于38 ℃时，菌体的酸性蛋白酶活力随着温度的升高呈递减趋势，当培养温度为38 ℃时，菌体的酸性蛋白酶活力表现最优。

图3 培养温度对白曲霉产酸性蛋白酶活力的影响

2.1.4 培养时间的选择

培养基的水分添加量为100 %，培养基的pH值为4，培养温度38 ℃，选择36 h、48 h、60 h、72 h、84 h 和96 h 总共6 个梯度作为培养时间，检测其酸性蛋白酶活力的大小确定培养时间。

通过图4 可以看出，随着培养时间的延长，菌体酸性蛋白酶活力逐渐升高，当培养72 h 时，曲样的酸性蛋白酶活力最高，但随后随着培养时间的延长，菌体出现老化，菌体的酸性蛋白酶活力逐渐降低，故选择72 h为培养时间。

图4 培养时间对白曲霉产酸性蛋白酶活力的影响

2.2 正交试验

根据培养基水分添加量、培养基pH 值、培养温度和培养时间的单因素试验结果进行L9(34)正交试验分析，正交试验因素选取水平见表1，正交试验数据及结果分析见表2。

表1 菌株培养条件正交试验因素水平

表2 菌株培养条件正交试验数据及结果分析

由正交试验结果可以看出，影响菌株生长的最大因素为培养温度，其次分别为培养基的水分、培养基pH 值及培养时间。从方差分析与显著性分析结果可以看出，不同水分添加量、不同培养基pH值、不同培养时间样本对于酸性蛋白酶活力（U/g）均不表现出显著性差异，不同培养温度样本对于酸性蛋白酶活力（U/g）均呈现出显著性差异。

4 个因素的最佳组合是A2B3C2D2，即培养基水分添加量为100 %，培养基pH 值为5，培养温度38 ℃，培养时间72 h。

按照所得出的最佳培养条件进行白曲霉的培养试验，设置3 个水平培养样本，计算其酸性蛋白酶活力的平均值（结果如表4），最后得到菌体酸性蛋白酶的活力为526.09 U/g。

表4 菌株在最佳培养条件下培养后的酸性蛋白酶活力

3 结论

通过单因素试验对白曲霉培养条件进行优化，培养基以麸皮作为主要原料，确定培养基水分添加量、培养基pH 值、培养温度和培养时间为影响菌株生长的显著因素。对4 组显著性因素进行L9(34)正交试验[5]，得到菌株实验室最佳培养条件为培养基水分添加量为100 %，培养基pH 值为5，培养温度38 ℃，培养时间72 h。在此培养条件下对试验菌株进行培养可以显著提高菌株的酸性蛋白酶活力，酸性蛋白酶活力值可以达到526.09 U/g。

表3 正交试验方差分析结果

酸性蛋白酶能在酿酒的酸性环境中，通过对原料中蛋白质的水解，促进微生物生长及酶的形成产生白酒风味物质，使酒体丰满醇厚[6]。提高白曲霉的酸性蛋白酶活力，探究高产酸性蛋白酶白曲霉实验室最佳培养条件，对其应用于酿酒生产具有指导意义。