基于高通量测序对不同陈放时间大曲细菌群落特征研究

李朝云，唐平华，罗 平，付宇豪，曾祥卫，佘露露*

(1.仁怀酱香白酒科研所，贵州遵义 564500；2.贵州茅台镇北街酒厂(集团)有限责任公司，贵州遵义 564500)

酱香白酒是中国特有的一种高度蒸馏酒，生产过程中采用高温制曲工艺，使其富集了大量的微生物和酶系[1]。在发酵前期积累和富集大量的香味物质，在陈放过程中，大曲继续网罗空气和环境中的微生物使其微生物群落更加丰富，微生物菌群在整个发酵过程不断演替，充分利用高粱和大曲中的各类物质，形成醇厚丰满的酱香型白酒基酒[2-4]。大曲作为酿酒糖化剂，主要是提供多样的微生物用于产酒和风味物质的产生[5]，同时补充了生产过程中的淀粉含量，有利于提高白酒产量[6]。分析大曲微生物的多样性，可以更好的了解大曲中的微生物种类和数量，为酒类风味物质的形成和微生物的选育提供理论依据[7]。

第二代高通量测序技术可以更加精确、快速的分析样品中微生物结构，成为白酒生产过程中微生物菌群研究的主要手段[8]。在制曲中，发酵初期曲块处于常温状态，适宜酵母大量增殖，在发酵过程中，温度逐渐升高，酵母菌生长被抑制，在发酵中后期仅能少量或不能检出酵母，但是可检出大量细菌和霉菌等[9]；在堆积过程中，初期主要是酵母的富集过程，在堆积前后酵母数量明显增加，且增加幅度有1～3 个数量级，增加幅度因堆积轮次和车间不同而略有差异[10-12]。

仁怀产区现阶段对酱香白酒生产工艺已经建立较完整的团体标准，但未从酱香白酒生产过程微生物菌落演替方面诠释酱香白酒生产过程中风味物质的产生和积累。探明大曲中微生物的种类和数量，是探究酱香白酒风味形成不可或缺的一部分。以陈放1 个月、4 个月、6 个月的大曲为研究对象，探究陈放不同时间大曲中的菌群结构，为后续探究酱香白酒风味形成夯实基础，对仁怀酱香型白酒产业的发展具有重要的意义，并为地方产业的推进及进步提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

原料：1 个月、4 个月、6 个月黄曲、黑曲、白曲分别命名为：XH、XK、XB、FH、FK、FB、SH、SK、SB，大曲样品来自贵州茅台镇北街酒厂(集团)有限责任公司曲房陈放大曲，将所得大曲粉碎后用四分法进行缩分取样、备用。

试剂：试剂盒Illmina 公司Hiseq Rapid SBS Kit v2(FC-402-4023 500 Cycle)等。

仪器设备：PCR 扩增仪（2720），美国应用生物系统公司；电泳仪（DYY-6C），北京六一生物科技有限公司；凝胶成像系统（BG-gdsAUTO(130)），北京百晶生物技术有限公司。

1.2 实验方法

酱香大曲样品由四川帕诺米克生物科技有限公司测序，PE250 测序方式，采用Qiagen Powersoil pro 试剂盒提取黄曲、黑曲和白曲样品中的DNA。在细菌16S rDNA V4 区域进行扩增，扩增引物Primer5'-3'：515F (5'-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3')和806（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'），PCR 扩增用酶为TOYOBO KO EPlus-Neo DNA Polymerase（KOD-401B），扩增体系为50µL：5 μL 10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo，5 μL 2 mmol/L dNTPS，3 μL 25 mmol/L MgSO4，1.5 μL 上游 引 物U515F，1.5 μL 下 游 引 物U806R，1 μL KOD-Plus-Neo(1U/μL)，2 μL DNA 模板，31 μL 超纯水。PCR 扩增反应条件为预变性94 ℃1 min，1个循环；变性94 ℃20 s，退火54 ℃30 s 和延伸72 ℃30 s，25～30 个循环；72 ℃5 min，1 个循环；4 ℃保温。每个样本进行3 次PCR 技术重复，取线性期PCR 产物等量混合后用于后续建库[13]。

扩增产物纯化后用2%的琼脂糖凝胶，每个样本进行3 次重复，取线性期PCR 产物等量混合后用NEW ENGLAND BioLabs 公司NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina 建库。进一步在Illumina HiSeq 2500测序平台开展高通量测序。

1.3 数据处理与分析

高通量测序所得序列通过FLASH 拼接双端序列、过滤去除低质量序列，基于Uchime 算法和gold数据库去除嵌合体，得到有效数据Effiective Tag。基于Usearch 软件，使用UPARSE 算法在97 %的一致性水平上进行Operational Taxonomic Unit（OUT）聚类。基于UCLUST 分类法与SILVA 数据库进行基因序列比对和注释分析。使用R 语言和ggplot2包作图。

2 结果与分析

2.1 α多样性分析

通过Usearch 算法在97 %的一致性水平上进行OTU 聚类。计算Chao 指数和ACE 指数（以确定物种丰富度）、Shannon 指数和Simpson 指数（以确定物种多样性）及检测到的物种数目，以描述样品中的细菌菌群多样性，分析测序指数结果见表1。

表1 大曲细菌群落α多样性指数

随着样本测序深度的增加，各大曲样品的真菌测序Shannon 指数和Simpson 指数都呈现逐渐平缓的变化趋势，说明测序数据结果已经覆盖绝大部分真菌，测序数据量合理、测序深度足够。可以看出随着大曲陈放时间延长，大曲中真菌多样性呈增长趋势，各个样品的Coverage 指数均达到了99.99 %以上，说明在此条件下的测序数据结果完全能够反映所测样本中真菌的真实情况，绝大部分的微生物种系类型都被检测到，在此基础上可以进行后续的研究分析。

2.2 物种组成结构分析

根据分类学分析结果，可以得知不同分组在各分类水平上的群落结构组成情况。根据群落柱形图，可以直观看出各样本在某一分类学水平上主要包括的微生物和样本中各微生物的相对丰度。

图2 门水平上细菌物种丰度组成

群落柱形图表明，样品中共检出10 个菌门，其中硬壁菌门（Firmicutes）是白曲中的第一优势菌门，在1 个月、4 个月和6 个月大曲中分别占总微生物93.61 %、92.05 %、92.61 %，Firmicutes 在XH 和FH 中含量分别为83.06 %、89.26 %，在SH 中含量降低到18.52 %，Firmicutes 在黑曲中含量分别为49.59 %、37.62 %、79.90 %；放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门(Proteobacteria)在XB、FB、SB 中含量无较大变化，在XH、FH、SH 中均呈现先减少后增大的情况，在FH 中Actinobacteria 和Proteobacteria分别占总微生物26.01 %，44.13 %；Actinobacteria在黑曲中含量先增加后减少，Proteobacteria 变化趋势相反，但最终含量均保持在10 %以内；Bacteroidetes 在SH 中占比超过1 %，其余菌门含量均低于0.5%。上述结果与已报道的酱香大曲微生物在门类结构上具有相似性[14-15]，郭敏[16]对酱香大曲制曲中微生物多样性检测发现在大曲制作过程中优势菌门是Firmicutes、Actinobacteria、Proteobacteria；Zhang 等[17]对清香型白酒酿造用大曲细菌组成及多样性研究发现细菌主要为Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria、Cyanobacteria、Chloroplast(蓝藻菌门)，其中Firmicutes 为优势菌门；樊建辉等[18]研究仰韶陶融型白酒酿造用大曲可培养微生物的多样性，结果表明Firmicutes 和Proteobacteria 为优势菌门；王晓丹等[19]从酱香大曲样品中共检出细菌6个菌门，主要为Firmicutes、Actinobacteria、Proteobacteria 等，并发现传统与机械大曲中所检出的微生物，在门水平上两种制曲所生产曲胚中细菌的生态多样性变化规律相似。

利用高通量测序方法从9 例大曲中共检出109个菌属，由图3 可知，枝芽胞杆菌属（Virgibacillus）是在9 例大曲中含量均超过10 %的菌属，在SB 中含量最高，达到总含量的35.74 %，但是在SH 中含量仅有3.42%；克罗彭斯特菌属（Kroppenstedtia）新曲中含量均高于12 %，随着陈放过程，从XB 中的12.03 %提高到SB 中30.86 %，但在黄曲中的含量变趋势正好相反，从XH中的32.11%，到SH含量仅3.52 %，黑曲中含量无明显线性关系；糖多孢菌属（Saccharopolyspora）在白曲陈放过程中期含量基本保持不变，在FK 中含量高达52.44 %，是所有样品中菌属含量最高的；葡萄球菌属（Staphylococcus）在FH 中含量达到13.45 %，Oceanobacillus（海洋芽孢杆菌属）在XB 中含量达到21.90 %，其余各类菌属含量均低于10 %；高温放线菌属(Thermoactionmyces)表现出分布广泛、耐受温度高、生长速度快的特点，具有重要的潜在应用价值和意义，是现阶段酱香大曲高温制曲的重要研究菌种，有研究从高温放线菌中提取分离高温酶如α-高温淀粉酶、纤维素酶、几丁质酶等应用于大分子物质的分解[20-23]。

图3 属水平上细菌物种丰度组成

根据大曲种类，在属水平对其分析得到，在1个月、4 个月、6 个月大曲中分别检出155 个、103个、225 个属，其中共有的有71 个属，分别单独含有的有41 个、6 个、99 个属，数据显示，在属水平上分析大曲在陈放过程中，属水平上数量先减少后增加，6 个月陈曲中属种类最多，这可能是大曲在陈放过程中网罗空气和环境中的微生物以丰富自身微生物种类使得微生物菌群更加丰富[24-25]。

2.3 通过LEFse分析组间菌群差异

在酱香高温制曲过程，通过LEfSe 分析探究不同陈放时间下大曲细菌微生态结构中物种的差异性，可以揭示制曲过程微生物结构特征和发酵、风味动力关键调控因子，有利于调控曲胚发酵参数和提升曲胚发酵质量。

图4 大曲属水平物种韦恩图

由图5 可以看出，在属水平上新曲中新鞘氨醇杆菌属（Novosphingobium）为显著富集的差异物种，在发酵过程中可由碳水化合物氧化产酸但不能发酵产酸，现阶段该菌株研究较少，是一种亟待开发的菌属[26-27]；4 个月大曲中Staphylococcus是显著富集的差异物种，Staphylococcus是革兰氏阳性球菌且多数为非致病菌，Thermoactionmyces也是显著富集的差异物种[28-29]，Thermoactionmyces大都适宜在高温下生活，表现出分布广泛、耐受温度高、生长速度快的特点，具有重要的潜在应用价值和意义[21]。从高温放线菌中提取分离高温酶如α-高温淀粉酶、纤维素酶、几丁质酶等应用于大分子物质的分解[20]，也有研究表明高温放线菌在酱香大曲细菌的相对含量占34.40%，运用PCR-DGGE 技术对酱香型和芝麻香型高温大曲中细菌群落结构进行分析研究，均发现高温放线菌的存在[30]，罗小叶等[21]以酱香型大曲为实验原材料，从茅台大曲中分离纯化5 株具有高温放线菌菌落形态特征的菌株，分别有3 株嗜温高温放线菌（Thermoactinomyces thalpohillus）、1 株甘蔗高温放线菌（Thermoactinomyces sacchari)、1 株高温放线糖莱斯菌（Laceyella sacchari），同时发现高温放线菌产生的水解酶对酿酒原料的分解及促进风味物质代谢产生具有一定的作用。在6 个月大曲中乳球菌属(Lactococcus)为显著富集的差异物种，这一类细菌为革兰氏阳性属化能自养型微生物，以碳水化合物发酵产酸，L(+)-乳酸为主，不产气，可能是白酒中乳酸的主要来源[31]。

图5 大曲LEFse差异分析图

2.4 PCA分析

PCA 是对多维数据进行降维处理，以此提取数据中最主要的因素，发现复杂数据的规律。在PCA分析中，样品的菌群越相似，则两个样品距离越近。

在图6 中，横坐标对差异影响贡献率为70.05 %，纵坐标对差异影响的贡献率为22.77 %。部分1 个月、4 个月、6 个月大曲距离很近，菌群相似，但是还是明显看出各类大曲样品并没有聚集在一起，这说明1个月、4个月、6个月大曲微生物构成差异较大。

图6 大曲PCA分析图

2.5 PCoA分析

PCoA 是根据特征值和特征向量排序从多维数据中提取出主要的元素和结构，选取贡献量最大的主坐标组合作图。两个样品的菌群组成越相似，两个样品距离越近。

在图7 中，PCoA 的横坐标对差异影响贡献率为48.82 %，纵坐标对差异影响的贡献率为16.66 %。通过基于Unweighted Unifrac 距离计算的PCoA，可以发现除4 个月大曲明显聚集在一起外，新曲和6 个月大曲样品距离较远，没有明显聚集的表现。

图7 大曲PCoA分析图

2.6 UPGMA聚类树

在微生物生态研究当中，UPGMA 分类树可以用于研究样本间的相似性，越相似的样本拥有越短的共同分支。如图8 所示，各个大曲样本除XK 和FK、XB 和SK 菌群组成相似外，其余大曲样本均无明显相似性，UPGMA 聚类树和样本属水平上的物种丰度聚类图结果与PCoA分析结果相似。

图8 样本间Beta多样指数UPGMA聚类图

3 结论

对北街酒厂陈放不同时间的9 例大曲细菌结构多样性进行研究，分别鉴定出10 个菌门和109 个菌属，通过对不同陈放时间大曲细菌多样性研究分析，明确Firmicutes 在白曲中为第一优势菌门，Actinobacteria、Proteobacteria 是仅次于Firmicutes 的两个菌门；Virgibacillus是大曲中的重要菌属，占微生物比例均超过10 %，Kroppenstedtia、Saccharopolyspora都属于大曲中优势菌属；对不同陈放时间的大曲差异性分析发现，在1个月、4个月、6个月大曲分别检出155 个、103 个、225 个属，其中共有的有71个属，分别单独含有的有41 个、6 个、99 个属，表明大曲在陈放过程中网罗了环境中的微生物使得大曲微生物菌群更加丰富，侧面印证了环境微生态会通过影响大曲微生物多样性进而影响酱香白酒的酿造，环境微生物是酱香白酒酿造不可或缺的微生物组成部分，大曲通过品温上升的筛选，最终实现环境、原料等外界中的有益菌向大曲迁移和富集；发现新曲中Novosphingobium为显著富集的差异物种，4个月大曲中Staphylococcus和Thermoactionmyces为显著富集的差异物种，6个月大曲中Lactococcus为显著富集的差异物种。这是大曲在开放式发酵条件下形成的具有标志性的菌群结构，或可成为大曲陈放时间鉴别的主要依据，对大曲PCA 和PCoA分析发现1个月、4个月、6个月大曲微生物构成差异较大。UPGMA 聚类树分析和大曲属水平上的物种丰度聚类图分析结果再一次印证不同存放时间大曲样本均无明显相似性。大曲提供了酱香白酒酿造过程主要的酶、氨基酸、糖等发酵前体物质，是酱香型白酒生产的“骨架”。所以，探究不同陈放时间大曲的微生物结构特征为酱香型白酒风味物质的产生提供了理论依据，同时为大曲中特征微生物的分离筛选培养提供数据支撑，从微生物角度诠释了高温大曲陈放过程是酱香白酒不可分割的酿造工艺。

图9 样本属水平上的物种丰度聚类图