截短侧耳素类抗生素及其耐药研究进展

丁超月　徐艳　孙丽　王兴宇　王宗朝　袁欣怡　瞿玮　潘源虎

摘要：截短侧耳素 （Pleuromutilins）是从担子菌纲侧耳属Pleurotus mutilus和Pleurotus passeckerianus中分离得到的二萜类抗生素，对革兰阳性菌和支原体具有良好的抗菌活性。截短侧耳素类药物用途广泛，泰妙菌素 （Tiamulin）和沃尼妙林 （Valnemulin）作为兽用药用于防治由病原微生物引起的猪痢疾、支原体肺炎等疾病；人用批准的瑞他莫林（Retapamulin）和来法莫林 （Lefamulin）主要用于治疗球菌感染和获得性细菌性肺炎。近年来，截短侧耳素类药物耐药监测表明，在病原微生物的rplC、rplD、23sRNA、Cfr和vga基因中报道了多种新的突变位点，导致侧耳素类药物敏感性降低。本文对已上市的截短侧耳素类药物进行回顾，并对近十年该类药物的耐药机制研究进行综述，以期为新型截短侧耳素类药物的创制提供参考。

关键词：截短侧耳素；抗菌活性；作用机制；耐药机制；PLSA型耐药；ABC-结合蛋白

中图分类号：R978.1       文献标志码：A         文章编号：1001-8751（2023）03-0166-07

Advances in the Research on the Resistance Mechanism of  Pleuromutilins

Ding Chao-yue，   Xu Yan，   Sun Li，   Wang Xing-yu，   Wang Zong-chao，   Yuan Xin-yi，   Qu Wei，    Pan Yuan-hu

（National Reference Laboratory of Veterinary Drug Residue，   Wuhan   430070）

Abstract： Pleuromutilin is a diterpene antibiotic isolated from Pleurotus mutilus and Pleurotus passeckerianu， which has good antibacterial activity against Gram-positive bacteria and mycoplasma. The pleuromutilin drugs are widely used. Tiamulin and Valnemulin are used as veterinary drugs to prevent and treat diseases such as swine dysentery and mycoplasma pneumonia caused by pathogenic microorganisms. Retapamulin and Lefamulin approved by human medicine are mainly used to treat coccus infection and acquired bacterial pneumonia. In recent years， the monitoring of pleuromutilin resistance has shown that a variety of new mutation sites have been reported in the rplC， rplD， 23sRNA， Cfr and vga genes of pathogenic microorganisms， resulting in reduced sensitivity to pleuromutilin drugs. In this paper， the listed pleuromutilin drugs were reviewed， and the drug resistance mechanism of pleuromutilin drugs in recent ten years was reviewed， in order to provide reference for the creation of new pleuromutilin drugs.

Key words： pleuromutilin; antibacterial activity; mechanism of action; resistance mechanism; PLSA resistance;  ABC- conjugated protein

截短侧耳素 （Pleuromutilins，图1）是20世纪50年代由哥伦比亚大学科学家从担子菌纲侧耳属 [Pleurotus mutilus （Fr.） Sacc. Drosophila subatrata 和 P. Passeckerianus Pilat]中分离的具有抗菌活性的双萜类化合物。截短侧耳素可与细菌的核糖体50S亚单位上的独特位点相结合，阻断核糖体P区域、干扰肽酰转移酶活性，从而选择性地抑制细菌蛋白的合成[1]。截短侧耳素本身抗菌活性弱、水溶性差，难于直接用于临床用药 [2]。对截短侧耳素进行结构改造，已成功研发上市4个截短侧耳素类药物。本文将对已上市的截短侧耳素类药物进行回顾，并对该类药物的耐药机制研究进行综述，以期为新型截短侧耳素类药物的研制及合理用药提供参考。

1 截短侧耳素类药物

1.1 泰妙菌素

泰妙菌素 （Tiamulin，图2）是1951年澳大利亚Kavangh首次提出，该药物为截短侧耳素经化学合成得到的氢化延胡索酸盐，是第一个截短侧耳素类动物专用抗生素[3]。泰妙菌素对金黄色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus）、支原体 （Mycoplasma）、放线杆菌 （Actinobacillus）、猪痢疾密螺旋体（Brachyspira hyodysenteriae）等有较强的抑制作用，对支原体的作用优于大环内酯类，对革兰阴性菌尤其是肠道菌作用较弱[4]。Hampson等[5]研究显示泰妙菌素对肠道螺旋体 （Brachyspira pilosicoli）和短螺旋体 （Brachyspira intermedia）的MIC范围分别为<0.1～1.0和<0.1～4.0 ?g/mL。泰妙菌素也被证明对鼻气管鸟疫杆菌 （Ornithobacterium Rhinotracheale）具有高活性，其MIC范围在≤0.012 ～ 0.25 ?g/mL[6]。泰妙菌素药物活性受环境影响较大，低浓度抑菌，高浓度杀菌，且在弱碱环境下杀菌作用最强[7-8]。泰妙菌素与土霉素、磺胺增效剂及其他磺胺类药物合用，可明显增强泰妙菌素的抗菌效果[9-10]。目前，泰妙菌素主要用于防治鸡慢性呼吸道病，猪支原体肺炎（气喘病）、放线菌性胸膜肺炎、密螺旋体性痢疾和猪的增生性肠炎[11]。

1.2 沃尼妙林

沃尼妙林 （Valnemulin，图3）是一种新型截短侧耳素类动物专用抗生素，对大多数革兰阳性菌、支原体和密螺旋体的体内外活性要优于泰妙菌素[12]。Hannan等[13]研究显示沃尼妙林对猪肺炎支原体的抑菌效果（MIC90 0.0005 μg/mL）是泰妙菌素 （MIC90 0.05 μg/mL）的100倍，是恩诺沙星 （MIC90 0.01 μg/mL）的20倍。在Jordan等[14]研究中沃尼妙林对不同来源的鸡毒支原体最低抑菌浓度（MIC）低于0.008 μg/mL，优于同条件下测定的泰妙菌素 （MIC值为0.015 μg/mL）。在Chen等[15]研究中，沃尼妙林对大肠埃希菌 （ATCC 25922）、鸡毒支原体 （S6）、葡萄球菌 （CICC 10373）、MRSA（11）的MIC值分别为16μg/mL、0.004μg/mL、0.063μg/mL和0.5μg/mL。沃尼妙林以盐酸盐形式于1999年被EMEA批准用于用于治疗或预防由猪痢疾短螺旋体 （Brachyspira hyodysenteriae） 引起的猪痢疾和肺炎支原体 （M.Pneumonia）引起的猪地方性肺炎[13-16]。2004年EMEA颁布了沃尼妙林可用于预防结肠菌毛样短螺旋体 （Brachyspira pilosicoli）感染引起的猪结肠炎和细胞内劳森菌（Lawsonia intracellularis）感染引起的猪增生性肠炎相关文件[17]，2006年被EMEA批准用于由兔产气荚膜梭菌引起的家兔流行性肠病 （Epizootic rabbit enteropathy） 的早期治疗[18]。

1.3 瑞他莫林

瑞他莫林（Retapamulin，图4）作为第一个人用截短侧耳素类药物，是该类药物应用上的一次重要突破。瑞他莫林在体外对耐甲氧西林葡萄球菌 （MRSA）和甲氧西林敏感葡萄球菌 （MSSA）均有较强的抑制作用，但是对含Cfr基因的MRSA无抑制作用。Candel 等[19]研究表明瑞他莫林浓度在0.125 mg/L时对MSSA和MRSA均有抑制作用，但是对18株利奈唑胺耐药的MRSA表现为耐药，MIC均大于32 mg/L。刘党生[20]发现瑞他莫林对葡萄球菌和β-溶血性链球菌有抗菌活性，对金葡菌和酿脓链球菌的MIC90分别为0.12和 ≤0.03 ?g/mL。Patel等[21]通过临床分离的53株金黄色葡萄球菌研究瑞他莫林的药物活性，结果显示49/53 （92%）菌株的MIC 值为0.25?g/mL，2/53 （4%）菌株的MIC为0.125 ?g/mL，2/53 （4%）菌株的MIC 值为0.5?g/m。此外，Patel对瑞他莫林的活性研究数据与 Candel等[19]、Woodford等[22]和Traczewski等[23]研究的数据基本一致。目前，瑞他莫林是体外抗凝固酶阴性葡萄球菌最有效的化合物，其抗菌活性是利奈唑胺的32倍[24-26]。主要用于治疗人体外局部皮肤感染所引起的短期脓疱疹或由葡萄球菌和链状球菌引起的伤口感染[27] 。

1.4 来法莫林

来法莫林 （Lefamulin，图5）是第一个在人体内全身使用的截短侧耳素类抗生素，2019年8月被美国食品和药物管理局（FDA）批准用于治疗社区获得性细菌性肺炎专用药[28]。来法莫林对革兰阳性和革兰阴性菌（如淋病奈瑟菌、流感嗜血杆菌和卡他莫拉菌）以及非典型细菌具有较强的体外活性，包括耐万古霉素粪肠球菌、耐氧氟沙星的肺炎链球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐多药（MDR）肺炎链球菌和耐大环内酯类肺炎支原体等耐药菌株[29]。2015年的全球耐药监测数据（SENTRY）表明，在19个不同地区分离得到的金黄色葡萄球菌，使用来法莫林药物浓度为0.25和0.12 mg/L时均可产生100%的抑制作用。来法莫林的药物活性验证实验中显示，在不同国家分离得到的1273株金黄色葡萄球菌中，含99.3%的菌株在药物浓度≤0.25 mg/L时被抑制，并且对不同源性、不同耐药性的金葡菌有相似的MIC值[30]。Waites等[31]研究了来法莫林对大环内酯类药物敏感和耐药的肺炎支原体菌株的抗菌效果，结果发现来法莫林对所有测试菌株MIC<0.008 μg/mL。在Ⅲ期临床的结果中表明，来法莫林对受试的1300位社区获得性细菌性肺炎（CABP）患者的治疗效果与莫西沙星相比具有非劣效性，CABP患者的四种症状 （咳嗽、咳痰、胸痛、呼吸困难）中至少有两种得到改善，无一例症状恶化的现象[32]。此外，File等[33]对比了莫西沙星和来法莫林的临床疗效，对CABP患者的治疗效果分别为89.3%和90.5%，相差不大。两种药物的临床疗效评价在治愈试验中的成功率均在85%以上。另一项研究结果显示接受来法莫林治疗的641位CABP患者中有5.6%出现了严重的不良反应，1.2%的患者在28 d内死亡。接受莫西沙星治疗的641位CABP患者有4.8%出现严重不良，1.1%的患者在28 d内死亡[34]。以上数据表明来法莫林在治疗CABP患者具有不劣于莫西沙星临床疗效。

2 截短侧耳素类药物抗菌作用机制

截短侧耳素类药物通过选择性地抑制蛋白质合成来达到抗菌目的，是一种独特的与原核生物核糖体相结合的一种机制。H?genauer[35]研究发现侧耳素类药物活性主要源于它通过与原核生物核糖体的肽基转移酶中心（PTC）中的50S核糖体亚单位结合来抑制原核生物蛋白质合成的能力，但对真核生物无影响。Novak等[36]进一步解释了这种抗菌机制。药物分子通过与核糖体之间的相互作用，影响了转运RNA （tRNA）在核糖体大亚基A位点和小亚基P位点的正确定位，导致肽键的形成受阻，进而影响蛋白质的合成。其次他们证实了截短侧耳素类药物的三环核心可与核糖体大亚基23S rRNA （A2503， U2504， G2505， U2506）结构域V基因的核苷酸以氢键的方式牢牢结合，其侧链部分则延伸与核糖体小亚基的P位点相结合，这种现象对侧耳素类药物是否抗菌活性有着重要影响。Eyal等[37]发现来法莫林与核糖体以一种诱导重排的复杂结合方式，通过核糖体23S rRNA 中U2585和U2506之间的U：U相互作用加强药物与核糖体之间的结合力 （见图6），区别于泰妙菌素与核糖体的简单氢键结合，并指出这种不同是引起两种抗菌药物活性差异的重要因素。此外，Paukner等[30]在来法莫林的抗菌机制研究中确定了C-11与原核生物核苷酸G2505或A2503之间可产生氢键作用，C-21羰基和C-14侧链与药物周围的核苷酸之间也可形成氢键，并表明该类药物产生氢键数量与其抗菌活性的强弱有一定的关系。侧链的结构特点是影响该类药物活性的重要因素，Falcó等[38]研究指出C14侧链深入核糖体亚基的P结合位点，通过三重过程来干扰细菌蛋白质的合成：首先与50S大亚基的23SrRNA相结合，抑制肽酰基转移酶来发挥抗菌作用，其次阻止转运RNA与P位点之间的相互作用，抑制蛋白质肽键的合成，使50S大亚基的形成受到抑制，进而起到杀菌作用。

3 截短侧耳素类抗生素的耐药机制

由于截短侧耳素类药物具有独特的抗菌作用机制（即特定的核糖体结合机制），因此与其他抗菌药物 （如β-内酰胺类、大环内酯类、氟喹诺酮类、四环素类或糖肽类）产生交叉耐药性的可能性较低[39]。而且自发性突变频率较低 （≤10?9），且进展缓慢，只有多次突变才能达到高水平的耐药。此外，敏感菌在4～8倍MIC条件下没有稳定的抗突变体，其中编码核糖体的23S rRNA、rplC和rplD基因突变是主要的体外耐药突变位点。在临床分离得到的耐药菌株耐药机制还包括Atp结合盒编码基因突变和甲基转移酶Cfr介导的基因突变[39]。

3.1 rplC和rplD基因突变

2003年Bosling等[40]首次展开了对截短侧耳素类药物耐药机制的研究。他们通过诱导筛选大肠埃希菌对侧耳素类药物的耐药情况，采用化学足迹法 （Chemical footprinting）发现了编码L3和L4蛋白的rplC和rplD基因突变和缺失可导致侧耳素类药物与核糖体的亲和力下降，从而引起大肠埃希菌耐药。Pringle等[41]和Gentry等[42]得到了相似的研究结论，他们发现猪肠道螺旋体和金黄色葡萄球菌的核蛋白L3产生的氨基酸突变可降低侧耳素类药物对自身的敏感性。2007年Davidovich等[43]对该耐药现象进行了补充，他通过对不同细菌核蛋白L3的氨基酸序列进行比对发现，致使药物敏感性降低的突变位点大多数位于L3的高可变区域，这一区域可影响药物与核糖体的结合位点，进而降低侧耳素类药物的抗菌活性。Kosowska等[44]研究结果表明低于2个单位以下的核蛋白L3氨基酸突变不足以使细菌产生很高的耐药水平，这也说明了侧耳素类药物不易产生耐药性 （见表1）。

3.2 23sRNA碱基突变

位于肽酰转移酶中心的 23S rＲNA 碱基突变也可介导截短侧耳类药物的耐药。在Pringle等[41]研究结果中发现肽酰转移酶中心23SrRNA的2032、2055、2447、2499、2504和2572位碱基突变可引起猪螺旋体对泰妙菌素耐药。同时在后续研究中观察了碱基单一突变对耐药水平的影响。在23S rRNA 2055、2447、2504 和 2572 位点的单点突变模型中显示均可降低侧耳素类药物对猪螺旋体的敏感性，其中2447和2504位点突变可引起利奈唑胺的交叉耐药。Li等[45]研究中揭示了鸡毒支原体对泰妙菌素和沃尼妙林耐药机制主要与23S rRNA 2058、2059、2061、2447和2503 位点的突变有关，其中A2503突变出现在了所有的鸡毒支原体的截短侧耳类耐药株中。另外，23S rRNA 2058和2059是最常见的大环内酯类耐药突变位点，在Pfister等[46]结果中显示2058和2059的突变菌株对侧耳素类药物和大环内酯类存在交叉耐药的情况。

3.3 甲基转移酶Cfr

通过甲基转移酶Cfr介导的基因突变可对氯霉素 （Phenicols）、林可胺类（Lincosamides）、恶唑烷酮类 （Oxazolidone）、截短侧耳素类（Pleuromutilins）和链阳霉素类（Streptogramins）等多种抗生素产生耐药性，即PhLOPSA 耐药表型[47]。2000年，Schwarz等[48]在呼吸道感染的小牛鼻腔拭子中分离的葡萄球菌中发现了Cfr基因。这种基因通过编码rRNA 甲基转移酶促进23S rRNA A2503位甲基化，同时抑制23S rRNA C2498位甲基化。氯霉素类、林可胺类、截短侧耳类、恶唑烷酮类、链阳菌素 A 类药物与细菌核糖体肽酰转移酶中心的结合位点均在核苷酸A2503附近。而甲基转移酶Cfr 介导的 A2503 位的甲基化可使上述药物的结合部位构象发生改变，是导致这些药物与细菌核糖体结合力下降产生耐药的主要原因[47]。Giessing等在对 A2503 位甲基化介导耐药机制的研究中发现，Cfr甲基化酶在催化该腺苷第8位产生甲基化后才导致细菌对PhLOPSA的耐药[49]。在2010年，SENTRY监测项目监测了新型侧耳素类药物来法莫林的耐药性，发现金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的总耐药率分别为0.18%和3.4%[30]。金黄色葡萄球菌分离株中Cfr基因突变率为0.018%，vga（A）基因突变率为0.11%，rplC基因突变率为0.05%。在大肠埃希菌菌株中，0.11%的菌株具有cfr基因，2.5%的菌株具有vga（A）基因，0.34%的菌株具有rplD突变[30]。Cfr耐药机制不仅流行于葡萄球菌，而且在动物源芽孢杆菌、肠球菌等革兰阳性菌以及大肠埃希菌中的染色体上和多重耐药质粒（PSCFS1）上都发现了cfr耐药基因，表明该基因可能具有传播能力并且已经逐渐流行开来[50]。

3.4 ATP结合盒转运子

vga和lsa基因编码的ATP结合盒转运子 （ATP－binding cassette transporters，ABC transporters）是最新的侧耳素类药物耐药机制，且陆续发现新的转运蛋白耐药基因。Li等[51]对全国范围内分离获取的582株截短侧耳类耐药葡萄球菌研究该类药物的新型耐药机制，结果显示：lsa（E） （412/582，70.8%）、vga（E）（78/582，13.4%）、vga（E）（45/582，7.7%）、vga（A） （21/582，3.6%），此外尚有部分菌株不含已有耐药机制 （26/582， 4.5%）。Gentry等[42]在瑞他莫林的耐药菌株中发现了vga（A）v和vga（A）基因，分别位于转座子Tn5406和质粒pVGA上，通过药物外排作用对林可胺类、链阳菌素A类和侧耳素类药物产生耐药。Malbruny等在无乳链球菌中发现了一种新型ABC转运子基因lsa（C），可介导对截短侧耳素类药物和林可胺类药物产生耐药，并可进行水平转移和传播[52]。在对瑞士分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的研究中结果中发现，有90%以上的菌株对泰妙菌素产生耐药。通过对耐药表型分析发现，有30%的耐药菌株含有vga（A）基因，在未知的耐药表型中发现了一种新的vga基因—vga（E）。vga（E）基因位于转座子Tn6133，在瑞士的MRSA菌株中有较高的检出率[53]。Kadlec等[54]在一株动物源MRSA中获得一个365bp的多重耐药质粒pKKS825，该质粒携带一种不同于以往的vga基因—vga（C）， 该基因可使菌株对泰妙菌素和沃尼妙林产生较高水平的耐药，同时还可引起林可胺类药物克林霉素和林可霉素以及链阳菌素A类的耐药。

尽管对侧耳素类药物耐药的分离株进行了表征，并对其耐药机制进行了描述，但该类药物的耐药率仍然很低。在2010年的来法莫林SENTRY监测项目中，金黄色葡萄球菌侧耳素药物耐药的总发生率为0.18%，凝血酶阴性葡萄球菌为3.4%。在金黄色葡萄球菌分离株中，0.018%携带cfr基因，0.11%携带vga（A）基因，0.05%携带rplC突变。在凝固酶阴性葡萄球菌中，cfr、vga（A）和rplD改变的发生率分别为0.11%、2.5%和0.34%[55]。

4 总结

截短侧耳素类药物毒性低、抗菌谱广、耐药率低且不易产生交叉耐药的优点是该类药物成为新药研发热点的主要原因。虽然目前细菌对截短侧耳素类药物的耐药率较低，但是该类药物中泰妙林菌素和沃尼妙林在兽医临床的大量使用对人用截短侧耳素类药物使用的安全性和有效性存在着严重威胁，因此必须重视该类药物的耐药监测，防止产生大规模的耐药现象。其次截短侧耳素类药物半衰期短、水溶性差和生物利用度低等特性一直限制该类药物的发展，对该类药物及其衍生物C14侧链进行合理的结构改造和修饰，区分不同基团对核糖体蛋白质的结合作用和药物活性的变化，研发出水溶性强、高效且安全的新型截短侧耳素类药物是今后该类药物研发的主要方向。

参 考 文 献

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收稿日期：2022-10-29

基金项目：国家重点研发计划 （2021YDF1800401）。

作者简介：丁超月，硕士，主要从事抗生素在机体内的代谢、排泄、残留与消除研究。

*通讯作者：潘源虎，副教授，主要从事新兽药研发和兽药的食品安全评价相关工作，在新药设计、合成与活性筛选、药物代谢与残留消除等领域进行大量的研究工作。