细菌外膜囊泡介导水平基因转移机制研究进展

李俊　李倩茹　吉星　何涛　魏瑞成　王冉

摘要：细菌可以通过多种水平基因转移方式，如自然转化、转导、接合等，在微生物种群内交换遗传物质，进行细菌种内和种间交流。外膜囊泡是新发现的一种水平基因转移方式，它是细菌在自然生长过程中分泌的纳米级球状结构，可以作为载体携带核酸、酶、毒素和毒力因子等多种生物分子进行远距离运输。目前已有多项研究报道了细菌外膜囊泡的组成成分、生物合成和转移传播机制。本文就外膜囊泡在水平基因转移机制方面的研究进展进行综述。

关键词：细菌；外膜囊泡；生物发生；水平基因转移；耐药性；毒力

中图分类号：R378        文献标志码：A         文章编号：1001-8751（2023）03-0178-07

Research Progress of Mechanisms of Bacterial Outer Membrane Vesicles Mediated Horizontal Gene Transfer

Li Jun1， Li Qian-ru1，2，  Ji Xing1， He Tao1，Wei Rui-cheng1，Wang Ran1

（1 Key Laboratory of Food Quality and Safety of Jiangsu Province-State Key Laboratory Breeding Base，

Key Laboratory of Agro-Product Safety Risk Evaluation （Nanjing） of Ministry of Agriculture and Rural Affairs，

Institute of Agricultural Product Safety and Nutrition， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，   Nanjing  210014；

2 School of Animal Science and Technology， Guangxi University，   Nanning   530004）

Abstract： Bacteria have evolved many ways to horizontal transfer their genetic materials within the microbial world， such as natural transformation， transduction， conjugation， etc. Bacterial outer membrane vesicle is a newly found method for the horizontal gene transfer. Outer membrane vesicles are nanoscale spherical bag-like structures， released predominantly by bacteria during their growth and reproduction. Many kinds of biological molecules， such as nucleic acid， enzymes， toxins， virulence factors can be carried by outer membrane vesicles for long distance transmission. There has been many papers reporting the components， biosynthesis and transmission of outer membrane vesicles. This review summarized the recent progresses on the horizontal gene transfer of bacterial outer membrane vesicles.

Key words： bacteria;   outer membrane vesicles;   biogenesis;   horizontal gene transfer;   antimicrobial resistance;   virulence

多重耐药菌感染是全球公共卫生面临的严重问题，因耐药菌感染导致的死亡人数在发展中国家的致死性疾病中排名第二位[1]。抗生素耐药基因可以通过多种水平基因转移方式传播[2]，如自然转化，转导和接合等。自然转化是指从环境中获得游离DNA，即从活细菌和死细菌中释放的DNA[3]；但是细菌必须处于感受态状态才能获得细胞外的DNA，目前研究发现细菌的感受态状态由20多个基因共同调控[4]，大约1%的细菌物种可以发生自然转化[5]。转导是噬菌体通过感染细菌将DNA转移给细菌，噬菌体可以携带多达100 kb的DNA，但是其侵袭的宿主具有特异性[6]。接合需要细菌间的直接接触，由连接供体菌和受体菌的性菌毛介导，质粒转移系统严格依赖于转移的遗传物质的特性[7]。

这些已知的水平基因转移机制有助于细菌之间的基因交换，但具有一定限制性，如有限的遗传负荷、宿主特异性和转移的遗传物质的种类等。近期研究发现一种由外膜囊泡（OMV）介导的新型基因转移方式。OMV是细菌自然生长过程中产生的球状纳米级结构（50～500 nm）[8]，在细菌毒力、调节宿主免疫反应和细胞通讯中发挥重要作用[9]，但对其在水平基因转移中的作用知之甚少。本文就目前OMV在水平基因转移中的作用和机制进展进行综述。

1 OMV的生物发生过程

OMV是由细菌外膜出芽形成的[8]。目前就OMV的产生过程存在三种假说[10]。第一个模型由Burdett提出，即细菌外膜和肽聚糖层之间共价连接的缺失或转移促进了OMV形成[11]。通过Braun脂蛋白[12]、大肠埃希菌Tol-Pal系统[13]和脑膜炎奈瑟菌RmpM[14]的突变证实外膜肽聚糖连接结构对于提高OMV产量的重要性。第二个模型为周质空间中肽聚糖片段或折叠不良蛋白质的累积对外膜施加压力，导致膜的弯曲率和最终出芽[15]。第三个模型中，Mashburn等确定了诱导膜曲率的分子，如假单胞菌喹诺酮信号（PQS）和B型脂多糖（LPS）等[16-17]。PQS不仅是OMV的诱导信号，还是OMV形成的直接效应子[18]，可诱导膜弯曲、结合磷脂和LPS[19]。PQS可螯合带正电荷的化合物（Mg2+和Ca2+盐），排斥LPS的阴离子，导致OMV产生[20]。此外，铜绿假单胞菌B型LPS的存在导致了膜的弯曲，从而诱导排斥LPS[21]。Berry等发现铜绿假单胞菌的细胞壁突变株不能合成B型LPS，因此其OMV产量降低[22]。

OMV的生物发生始于指数生长期，在稳定生长期达到最大峰值[23-24]。然而，许多因素（如温度、培养基、抗生素等）可定性或定量地影响OMV的产生。Baumgarten等[25]发现热应力条件下（55 ℃）恶臭假单胞菌OMV的产量显著增加。另有研究发现营养限制和处于化学或物理压力诱导因素会促使OMV增加[26]。细菌产生OMV是其应激反应机制之一，以提高细菌存活率，是细菌感染期间对宿主环境的适应机制[27]。

2 OMV的组成成分

OMV是双层膜纳米级球形结构，大小为50～500 nm，外膜主要由LPS、磷脂、膜蛋白和肽聚糖成分组成，囊泡腔内含有周质蛋白、胞质组分和核酸[28]。OMV的组成成分因细菌生长条件而不同，还受到宿主和细菌之间相互作用的调节[29-30]。研究表明，OMV中存在外膜蛋白、周质蛋白和不同的毒力因子，它们参与细菌对宿主的粘附和侵袭过程[23]。通过蛋白组学可以鉴定出OMV相关蛋白种类，主要分为两大类：（1）外膜蛋白。包括膜蛋白，如孔蛋白、转运系统成分、粘附素、磷脂酶和蛋白酶等。铜绿假单胞菌的外膜囊泡中广泛鉴定出的孔蛋白是OprF和OprH/OprG[31]，脑膜炎奈瑟菌的OMV中含量最多的是孔蛋白A，H因子结合蛋白和不透明相关蛋白C[32]，在福氏志贺菌的OMV中检测到外膜磷脂酶A[33]，牙密螺旋体的OMV中含有对宿主细胞造成损害的活性蛋白酶[34]。（2）囊腔蛋白。主要由毒素组成，如霍乱弧菌的霍乱毒素、肠毒性大肠埃希菌的溶细胞素A、幽门螺杆菌的空泡形成细胞毒素、空肠弯曲杆菌的细胞致死扩张毒素[35]，以及酶类，如蛋白酶、糖苷酶和脲酶等[36]。

脂质在OMV的结构中起重要作用，由磷脂和LPS组成。磷脂构成外膜的内层，LPS仅位于外膜的外表面上。大肠埃希菌OMV的磷脂主要由磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油和溶血磷脂酰乙醇胺组成[37]。脑膜炎奈瑟氏菌OMV主要包括磷脂酰甘油和磷脂酰乙醇胺[32]。在铜绿假单胞菌OMV中，大量检测到磷脂酰甘油和硬脂酸，证明OMV具有更强的刚性[25]。幽门螺杆菌的OMV以心磷脂为主要脂质成分[23]。OMV上存在的LPS条带类型取决于出芽的部位[8]。LPS拥有两种不同类型的O多糖，即A型和B型的LPS，其不同的化学成分赋予了不同的表面和抗原特性。在铜绿假单胞菌的OMV中，仅发现B型LPS，而在牙龈卟啉单胞菌中，OMV主要由A型LPS组成[38]。

OMV的外膜表面或囊泡腔中可携带DNA和RNA。用DNase I和RNase处理OMV可以观察到明显的区别[24]。多项研究报道大肠埃希菌[39]、淋病奈瑟菌[40]、铜绿假单胞菌[41]、鲍曼不动杆菌[42]等分泌的OMV携带DNA。在霍乱弧菌和铜绿假单胞菌OMV中还检测到RNA序列[43]，OMV相关的RNA可通过降低宿主的免疫反应来促进铜绿假单胞菌的致病性[43]。最近在衣原体和军团菌菌株的OMV中还发现了tRNA片段，直接参与破坏宿主菌基因翻译和mRNA稳定性[44]。

3 OMV的生物功能

OMV可携带核酸、酶、毒素和毒力因子等生物分子进行远距离运输，保护它们免受降解和稀释，OMV介导细菌种内和种间进行交流，并有助于与宿主的相互作用[9]。此外，OMV还参与营养物质的获取、应激反应以及病原菌生存所必需的微环境的形成等[30， 45]。OMV中蛋白酶、磷酸酶和糖苷酶的包装在复杂分子的降解中起重要作用，促进了营养物质的吸收利用[36]。黄色粘球菌OMV中的碱性磷酸酶会导致磷酸盐的释放，从而促进微生物菌群的平衡[46]。此外，OMV表面相关的蛋白质和DNA是细菌生长过程中碳和氮的重要来源[13]。

OMV在微生物毒力和调节宿主免疫反应中发挥重要作用[30]。OMV通过释放胞外多糖参与生物被膜基质的形成，从而促进细菌聚集[47]。在囊性纤维化患者中，铜绿假单胞菌能够形成生物被膜，导致手术部位感染、骨科种植体周围骨感染和肺部感染。研究发现PQS通过在生物被膜发育过程中以高度动态的生物物理机制诱导铜绿假单胞菌和其他假单胞菌属物种的OMV形成。值得注意的是，与细菌生物被膜附着和成熟阶段相比，OMV的产量在生物被膜分散过程中显著上升，可能由于PQS诱导的OMV增强了铜绿假单胞菌感染中的生物被膜分散，从而促进了生物被膜的分解[16]。另有研究报道气单胞菌属OMV可剂量依赖性地促进生物被膜形成[48]。Bielaszewska等[49]发现OMV增加了细菌对肠上皮的粘附，以帮助它们抵抗物理消除。OMV携带的毒素和毒力因子比它们的可溶物形式更为活跃[15]。OMV中包含多种致病分子，包括孔蛋白和LPS等[50]，可强烈调节免疫反应，导致细胞因子和趋化因子的产生，从而诱导炎症反应的激活[51]。

OMV还被认为是基因转移的载体[52]，已有多项研究在OMV中检测到质粒、染色体DNA片段、噬菌体DNA和RNA片段[53-54]。本文着重对OMV在水平基因转移中的作用研究进展进行综述探讨（表1）。

4 OMV介导的水平基因转移

目前研究发现，水平基因转移可以通过转化、转导，接合以及新发现的OMV方式进行[3]。Kolling等[39]首先发现OMV可以作为水平基因转移的载体，他们纯化了大肠埃希菌O157： H7的OMV，用DNase I处理OMV证实了囊泡内部携带基因，通过聚合酶链反应（PCR）在外膜囊腔中检测到eae、uidA、stx1和stx2等毒力基因，这些基因可通过OMV转移到受体菌大肠埃希菌JM109，并且在JM109转化子中鉴定到毒力基因，证实了OMV可介导毒力基因的水平转移过程。这些初步发现为其他研究奠定了基础，深化了OMV在水平基因转移机制中的作用。随后Yaron等[55]研究证明OMV可介导遗传物质在不同菌种之间发生交换。研究人员从大肠埃希菌O157： H7的培养上清液中分离出OMV，经DNase I处理和PCR鉴定在OMV内检测到染色体基因eaeA和uidA，噬菌体相关基因stx1和stx2，pO157、pO157和p4821质粒相关基因hlyCA， L7095和mobA。以大肠埃希菌JM109和肠炎沙门菌为受体菌进行转化实验，通过菌落PCR扩增鉴定到靶基因，转化子对Vero细胞毒性比受体菌提升6倍，表明转化子获得毒力基因后，致病性增加。

除大肠埃希菌外，其他革兰阴性菌也可利用OMV作为水平基因转移载体。Ho等[56]证明，牙龈卟啉单胞菌的OMV可介导同一菌种之间毒力基因的转移。OMV内腔中携带菌毛和超氧化物歧化酶的编码基因fimA和sod。在转移实验中，将2.1 kb的红霉素抗性基因ermF-ermAM融合入fimA基因进行标记，牙龈卟啉单胞菌49417通过产生OMV将红霉素抗性基因ermF-ermAM和毒力基因fimA转移给敏感菌株33277。

Rumbo等[57]首次发现OMV可以介导耐药质粒水平转移。研究人员以携带碳青霉烯类blaOXA-24质粒的鲍曼不动杆菌临床菌株为对象，通过DNase I处理和点印迹实验证明blaOXA-24基因存在于耐碳青霉烯类临床菌株产生的OMV中。通过与碳青霉烯类敏感的鲍曼不动杆菌共孵育实现OMV介导的耐药质粒转化，获得耐药质粒后，敏感受体菌的MIC达到>32 μg/mL。并且转化过程非常迅速，3 h内即可发生，24 h内达到平台期[57]。Chatterjee等[42]研究了鲍曼不动杆菌菌株A_115产生的OMV介导blaNDM-1基因传播的能力。通过DNase I处理、PCR和点印迹分析证明blaNDM-1基因存在于OMV内腔中。采用不同浓度的OMV与鲍曼不动杆菌和大肠埃希菌JM109的β-内酰胺敏感菌株进行转化。转化子数量与OMV浓度成正比关系，当使用50 μg的OMV与鲍曼不动杆菌ATCC 19606共孵育，转化效率最高，达到4.62×109 CFU/mL。转化子blaNDM-1基因呈阳性，对β-内酰胺类抗生素呈现广泛耐药，同时MIC值更高。使用游离质粒与β-内酰胺敏感菌株一起孵育时，没有获得转化子，证明转移完全由OMV介导[42]。

将DNA装载到OMV中可保护其免受不利环境条件的影响。例如，在热环境中，细胞外DNA的完整性受到高温和DNase I作用的影响，而OMV内的DNA仍可以发生水平转移，这是细菌额外的生存优势。Blesa等[58]在嗜热栖热菌中发现了基于OMV的水平基因转移途径。研究人员收集了携带pMKpnqosYFP质粒的嗜热栖热菌产生的OMV，在对OMV采用DNase I处理后，通过琼脂糖凝胶电泳和Hind III消化质粒证实了OMV中质粒的完整性，表明OMV为其中的DNA提供了保护。使用ΔpilQ和ΔpilA4嗜热栖热菌作为受体菌进行转化实验，在热环境和存在DNase I的情况下，与游离DNA相比，OMV介导的转化效率更高，证实OMV在不利条件下可作为载体为水平基因转移提供保护[58]。

5 OMV介导水平基因转移的影响因素

目前多项研究探索了OMV在水平基因转移中的作用，但转移的分子机制以及该过程的影响因素尚不清楚。Fulsundar等[59]发现高温、干燥、营养缺乏、紫外线和抗生素暴露导致巴伊不动杆菌OMV释放增加。当细菌用氯霉素和庆大霉素处理并在没有营养物的情况下生长时，观察到OMV中质粒的数量显著增加，从而增加了质粒的转移频率。抗生素和营养缺乏条件处理，导致细菌OMV直径显著增加。与其他处理相比，庆大霉素作用下产生的OMV的zeta电位显示出更多的负值。这些研究结果证明应激因素会影响OMV释放、DNA含量以及OMV大小。

Tran等[61]系统评估了质粒类型和受体/供体菌株对转移效率的影响。以pLC291、pUC19和pZS2501质粒转化大肠埃希菌菌株，三种质粒大小相似，但复制起点不同。pLC291和pUC19是高拷贝质粒，pZS2501是低拷贝质粒。通过PCR分析证实这三种质粒均可分泌于大肠埃希菌OMV。三种OMV的蛋白含量相似，但含有pZS2501质粒的OMV体积增大。通过实时定量PCR分析评估质粒在OMV中的阳性率，发现低拷贝质粒的负载能力低，每pg蛋白的OMV中携带0.49×103拷贝的质粒。高拷贝pLC291和pUC19质粒显示出高负载潜力，每pg蛋白OMV分别有2.58×103和482.7×103拷贝。这些发现表明质粒特征影响OMV的直径和质粒负载量。此外，他们还研究了不同菌株释放OMV的特征。在转化实验中，使用维氏气单胞菌，阴沟杆菌和大肠埃希菌作为受体菌株。用携带pLC291质粒的大肠埃希菌作为供体菌。不同受体菌株接收pLC291质粒后，释放的OMV中含有相同的蛋白质和质粒量并且具有相似的大小。进而评估了OMV进行细菌种间水平基因转移的潜力。从维氏气单胞菌，阴沟杆菌和大肠埃希菌中分离出含有pLC291的OMV，再将其与五种不同的受体菌（维氏气单胞菌，阴沟杆菌，大肠埃希菌，紫色杆菌和铜绿假单胞菌）进行转化，对质粒转移时间进行量化。维氏气单胞菌通过OMV在更短的时间内将pLC291质粒转移到不同的受体菌株。无论供体菌种如何，铜绿假单胞菌在较短的时间内获得了抗生素耐药性。维氏气单胞菌比阴沟杆菌、大肠埃希菌和紫色杆菌更快地接收质粒。这些结果表明，获得DNA的能力由供体/受体细菌的种类共同决定[61]。

Tran等[64]后续深入研究了质粒特征（质粒拷贝数、质粒大小和复制起点）对OMV介导的水平基因转移的影响。在pSC101质粒复制起点引入三个特定点突变以增加质粒拷贝数。将拷贝数增加的pSC101+、pSC101++和 pSC101+++电转到供体大肠埃希菌菌株中。增加的质粒拷贝数不会影响纯化的OMV的大小和数量，但会改变包载到OMV中的质粒数量。转移实验表明，质粒转移时间随着质粒拷贝数的增加而减少。此外，研究评估了质粒大小对OMV负载的影响。基于质粒pLC291，通过插入非功能性λ噬菌体DNA产生了四种不同大小的质粒。获得的质粒大小分别为3.5、7、10和15 kb，分别命名为pLC-3.5、pLC-7、pLC10和pLC15。用每种质粒转化大肠埃希菌菌株，并纯化OMV。随着质粒大小的增加，OMV的产量几乎没有增加。动态光散射分析表明OMV尺寸与质粒大小无关。此外，荧光定量qPCR结果表明，质粒大小与OMV中质粒拷贝数成反比。为了评估质粒来源对OMV产生的影响，他们基于质粒pLC291构建了三个大小相同（3.5 kb）但来源不同的质粒：pMB1、具有RK2和ColE1双重来源的pLC和SC101，转化入大肠埃希菌后，纯化OMV。不同来源质粒的大肠埃希菌产生的OMV的大小相近。不同来源的质粒（pMB1、pLC和SC101）在OMV中的负载不同：对于pMB1，每pg蛋白的OMV中携带364.45×103拷贝，而对于pLC和SC101，每pg蛋白OMV中携带3.13×103和1.12×103拷贝。随后进行了OMV介导的水平基因转移实验，使用大肠埃希菌作为受体菌株，并添加相同数量的OMV。研究发现基因转移频率受到质粒复制起点的强烈影响。携带pLC质粒的OMV的转移频率大约是携带pMB1和SC101质粒的OMV的10倍。由此可见，质粒的数量和大小影响了OMV的包载效率，而复制起点影响了OMV的转化频率[64]。

6 总结

水平基因转移促进细菌之间遗传物质的交换，并在许多微生物的进化中发挥重要作用。已知的水平基因转移方式（自然转化、转导和接合）对细菌物种之间的遗传多样性具有重要贡献。近期研究发现OMV是水平基因转移的新型途径。OMV不仅参与微生物毒力，调节宿主免疫反应，还可通过携带质粒、染色体DNA片段、噬菌体DNA和RNA片段水平基因转移，介导遗传元素在微生物群体间传播交换。并且供体/受体菌株种类，遗传物质类型，外界环境条件（高温、营养缺乏、紫外线和抗生素）等均会影响OMV介导的水平基因转移频率。目前OMV分泌的调控机制，包载物质的选择性，与受体细胞膜融合的方式等尚不清楚，需要更进一步深入研究。

参 考 文 献

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收稿日期：2022-10-26

基金项目：国家自然科学基金项目（32102728）；江苏省农业科学院探索性颠覆性创新项目（ZX（21）1224）；

江苏省自然科学基金（BK20200056）；江苏省自主创新项目（CX（20）1011-1）。

作者简介：李俊，博士，助理研究员，主要从事细菌耐药性分子机制及防控策略研究。

李倩茹（并列第一作者），本科，主要从事细菌耐药性研究。

*通讯作者：何涛，博士，副研究员，主要从事细菌耐药性产生及传播分子机制研究。