抗细菌耐药性策略：质粒消除

刘泉　曹征征　崔潞晴　郭凯旋　张凡　戴梦红

摘要：细菌可以通过多种方式产生对抗菌药物的耐药性，其中最为常见的方式之一为获得携带有耐药基因的质粒。耐药质粒可以在菌株之间转移，导致耐药性的广泛传播，因此消除耐药质粒是缓解细菌耐药扩散的关键。本综述介绍了基于物理、化学以及生物学的细菌耐药质粒消除方法的研究进展，并阐述了质粒消除的机理，为今后探寻安全有效地消除耐药质粒的研究方法提供参考。

关键词：耐药性；质粒；质粒消除；消除机制；抗生素；耐药基因

中图分类号：R378       文献标志码：A         文章编号：1001-8751（2023）03-0185-07

Strategies to Combat Bacterial Resistance： Plasmid Curing

Liu Quan，   Cao Zheng-zheng，   Cui Lu-qing，   Guo Kai-xuan，   Zhang Fan，   Dai Meng-hong

（The Cooperative Innovation Center for Sustainable Pig Production， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070）

Abstract： acteria can develop resistance to antimicrobial drugs in a variety of ways， among which the most common way is to obtain plasmids carrying resistance genes. Therefore， strengthening the research on the elimination methods of resistant plasmids becomes critical to alleviate the increasing severity of bacterial drug resistance. In this review， the research progress of plasmid elimination methods based on physics， chemistry and biology is introduced， and the mechanism of plasmid curing is described， which will provide reference for the research methods of safe and effective plasmid curing in the future.

Key words： antimicrobial resistance; plasmids; plasmid curing; curing mechanism; antibiotic; antibiotic resistance gene

抗生素耐药性是全世界范围内一个日益严重的公共卫生问题，目前已被视为“同一健康”中的重点之一。长期抗生素的滥用导致了严重的环境污染问题，不断促进耐药菌甚至超级细菌的产生。一项新的研究发现在2018年至2000年间，全球抗生素使用量增加了46%[1]。在动物身上不适当地使用抗生素也是导致抗生素耐药性上升的原因之一。据估计，抗生素消费总量的三分之二用于动物生产[2]。2013年，全球动物生产中的抗生素使用量为13.1万吨，预计2030年将增加到20万吨[3]。导致抗生素耐药多样性和持久性存在的另一个关键因素是抗生素耐药基因。它们通常位于质粒上，质粒是具有自主复制能力的环状DNA片段。耐药性质粒通常是接合型质粒，不仅能够启动自身的转移，还能带动其他质粒的转移[4]。非接合型质粒，不能自我传播，但是能够在接合型质粒转移基因的诱导下被转移到特定宿主；这种转移既可以垂直进行，也可以通过水平转移进行[5]。

作为一种新型环境污染物，抗生素耐药基因先于抗生素的发现而广泛存在于自然环境中[6]。在农田生态系统中，土壤已成为重要的耐药基因储存库，土壤中的耐药基因能够通过受污染作物和地下水系统进入食物链，对人类健康造成潜在威胁[7]。养殖场、河流湖泊、医疗废水也都是耐药基因的主要储存库，促进了耐药基因在环境中的传播。对临床治疗产生威胁的耐药基因包括编码超广谱β-内酰胺酶的基因（例如CTX-M）、碳青霉烯酶耐药基因（例如OXA、KpC和NDM）、黏菌素耐药基因（例如mcr-1）和替加环素耐药基因（例如tetX3、tetX4）。CTX-M型耐药菌已经在全球范围内被分离出来，其发病率急剧增加，并仍处上升趋势。blaCTX-M基因本身是高度可变的，现已确认了207多种CTX-M变种[8]。NDM-1于2008年首次从一名在印度新德里住院的患者分离出的肺炎克雷伯菌株中发现[9]，随后NDM-1阳性菌株在全球范围内被发现。blaNDM基因的广泛传播很大程度上是由某些质粒介导的，尤其是IncX3型质粒[10]。由于NDM酶的不断进化，目前已发现了24种NDM变种，这对临床管理和公共卫生构成重大挑战[11]。2016年，首次在中国的人源和动物源的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌分离株中报道了mcr-1[12]。大多数携带mcr-1的质粒是可转移的，IncI2、IncHI2和IncX4是携带mcr-1的主要质粒类型[13-14]。多黏菌素，被认为是抵抗多重耐药革兰阴性菌感染的最后一道防线。但携带黏菌素和碳青霉烯耐药基因的菌株仍在世界范围内继续传播，是临床治疗的重大挑战和对公共卫生的重大威胁。

内源质粒可以自发地从细菌中丢失，但其丢失效率很低[15]，且大部分内源质粒在细胞内是稳定存在的。因此，开发新的策略来限制质粒介导的抗生素耐药性的传播是至关重要的。质粒消除是指从细菌中去除质粒的过程。质粒消除有可能去除菌群中的耐药基因，同时保留完整的细菌群落，因此其可作为对抗抗生素耐药性的策略。研究发现可以采用物理、化学、生物学的方法来提高耐药质粒在细菌中的丢失效率，从而达到消除耐药质粒，恢复细菌对抗生素敏感性的目的。本文对质粒的消除方法进行了分类和总结，并对质粒的消除机理进行了介绍。

1 物理消除方法

物理消除法是质粒消除方法中最简单的方法，其操作方便，且对细菌自身基因组的损害较小，不存在突变风险。主要是采用高温、高压、微波、紫外线照射等方式来消除耐药质粒。Mesas等[16]通过使用高压电穿孔方法诱导细菌内质粒丢失，结果显示质粒pRS2在电穿孔后以33.3%的频率丢失，质粒pRS3在电穿孔后以25%的频率丢失。推测利用高压消除细菌内质粒的原理为高电压可以击穿细菌的细胞壁和细胞膜，使质粒流出，导致细菌质粒丢失。Klassen等[17]将罗伯茨放线菌（Wingea robertsiae）CBS6693暴露于254 nm的紫外线下100～360 s，结果显示菌株中线性质粒pWR1A和pWR1B均消失，推测细菌质粒可能经紫外线照射而消失。Berzin等[18]利用2.45 GHZ微波处理细菌，结果显示梭氏菌（Clostridium）MT962质粒pMT351被消除，且消除效率达到42%～47%。物理消除法可用于去除拷贝数较低或化学试剂难以进入细胞的细菌质粒。

2 化学消除方法

2.1 化学试剂

2.1.1 表面活性剂

十二烷基磺酸钠（SDS）是最常用的一种表面活性剂，利用其消除质粒主要有两种机制：一是使内源质粒从细胞膜上的附着位点脱离，抑制质粒的正常复制，最终导致质粒在分裂过程中丢失；二是当SDS到达细胞质后，通过将蛋白质解离成单个亚基从而干扰细胞新陈代谢，部分与质粒复制有关的蛋白失去活性，导致质粒的丢失[19]。朱美秋等[20]利用高温-SDS法对菌株LBA4404中的质粒进行消除实验，经处理后的菌株内质粒被完全消除。Paul等[21]利用浓度分别为8%，10%及12%的SDS对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）中编码金属β-内酰胺酶抗性的blaNDM-1和blaVIM-2质粒进行清除，结果显示SDS成功清除细菌内质粒，且消除效率达到100%。SDS作为一种阴离子消除剂，具有消除质粒的功能，但由于具有高毒性和诱变性质，故临床很少使用。

2.1.2 嵌合染料及其他

嵌合染料消除剂主要包括吖啶黄、吖啶橙、溴化乙锭（EB）等，其作用机制是它们可以优先与细菌内质粒结合，随即嵌入到DNA双链中，在质粒上形成切口，阻碍质粒的正常复制，从而造成质粒的丢失。在沙门菌[22]、铜绿假单胞菌[23]和鲍曼不动杆菌[24]中已经证明溴化乙锭可以消除细菌内源质粒。Saranathan等[24]利用稀释至亚抑菌浓度（320～5120 μg/mL）的溴化乙锭对鲍曼不动杆菌进行质粒消除试验，结果显示细菌内质粒丢失，并发现质粒丢失后菌株恢复了对两种以上抗生素的敏感性，表明鲍曼不动杆菌的耐药性与菌株自身携带的质粒有关。Sa?lam等[25]利用吖啶黄消除法对植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）进行质粒消除，结果显示菌株内质粒在80 μg/mL浓度下被成功消除。Dhanarani等[26]将链球菌（Streptococcus）、微球菌（Micrococcus）分别置于含有75、100 μg/mL吖啶橙的营养肉汤中，并在37 ℃下培养24 h，检测到细菌内含有的4.2 kb及5.1 kb大小的质粒被成功消除。EB的质粒消除效率通常比较高，且对多种细菌有效，但由于EB具有强大的诱变活性，并且具有明显的毒性和致癌性，因此其实际应用很少。此外，结晶紫[27]、萘啶酸[28]也都具有质粒消除作用。

2.2 化学药物

2.2.1 吩噻嗪类

杂环有机化合物例如吩噻嗪，已广泛用于人类医学，最初是作为抗蠕虫药，现在多用于精神病的治疗。吩噻嗪类药物已被证明对某些细菌和质粒具有活性[29-30]。Spengler等[31]利用吩噻嗪类化合物及其衍生物针对大肠埃希菌（Escherichia coli）K12LE140携带的质粒进行消除实验，证明吩噻嗪具有消除质粒的能力。推断当此类化合物作用于细菌质粒时，使质粒出现切口，该过程导致质粒解螺旋，从而影响质粒进行正常复制[32-34]。Costa等[35]将耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Meticillin-resistant Staphylococcus aureus）HPV107置于含有氯丙嗪的培养基中连续传代，发现细菌内含有的大小为30 kb的质粒消失。Molnár等[36]发现在异丙嗪和丙咪嗪的存在下，从藤黄微球菌（Micrococcus luteus）中分离出来的DNA促旋酶活性受到抑制。说明吩噻嗪类化合物可以通过阻断DNA促旋酶的活性使质粒复制受阻。有研究发现一些质子泵抑制剂增强了吩噻嗪类化合物对大肠埃希菌K12LE140的质粒消除效果[37]，表明质子泵抑制剂可以增强质粒消除药物的活性。

2.2.2 抗菌药物

一些抗菌药物在较高浓度时可以抑制细菌生长，但在亚抑菌浓度时可以消除细菌内携带的耐药质粒。Brandi等[38]选择3株含有相同抗性基因的三种不同质粒（pT713、pJLL144、pRK2）的大肠埃希菌菌株进行质粒消除试验。实验结果表明，在37 ℃条件下，抗生素可导致部分质粒的丢失。在曲伐沙星浓度为10 μg/mL时，观察到质粒pJLL144丢失，消除效率达到50%。当曲伐沙星在一半的最小抑菌浓度下，大约30%的质粒pRK2丢失。最后，对从曲伐沙星处理的细胞中提取的质粒pT713进行了定量PCR，观察到该质粒在最小抑菌浓度条件下损失了大约50%，结果表明曲伐沙星可作为细菌质粒消除的一种有效方法。新生霉素作为拓扑异构酶抑制剂也可以有效治疗许多革兰阳性细菌的质粒，包括粪肠球菌[39]、植物乳杆菌[40]、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌[41]等。此外，头孢菌素类药物对细菌的耐药质粒也有一定的消除能力[42]。

三氯生，作为一种广谱抗菌剂，被广泛应用于消毒剂、化妆品、香皂等中，在低浓度时具有抑菌作用，而在高浓度时具有杀菌作用。Riber等[43]将三氯生嵌入到有机硅水凝胶的互穿聚合物网络中可以促进细菌群体中的质粒丢失。该研究发现，使用远低于最小抑菌浓度的三氯生可以导致大肠埃希菌中质粒pMIB4的丢失，且随着三氯生浓度的增加，细菌中质粒丢失显著增加，但高浓度的三氯生会使细菌形成适应性反应，导致其对三氯生产生耐药性，这表明三氯生在未来治疗和医疗目的的应用中存在局限性。

2.3 纳米颗粒

近年来，纳米颗粒被认为是对抗细菌耐药性的潜在工具[44]。铜和铂纳米颗粒有助于消除耐药质粒，因为它们与超螺旋质粒DNA或参与复制、转录和重组过程的拓扑异构酶相互作用，最终导致质粒的消除[45-46]。另一种类型的纳米颗粒，有机纳米颗粒，通过影响质粒DNA的完整性和结合能力显示出对耐药菌的治疗活性[47]。Bharathan等[48]研究了果胶包裹的铂纳米颗粒（PtNPs）的质粒消除效应。实验结果表明，在斑马鱼感染模型中，果胶包裹的铂纳米颗粒在体外和体内均能导致大肠埃希菌U3790质粒的丢失，从而导致美罗培南和头孢曲松的MIC显著降低。在10 μmol/L浓度下观察到质粒消除现象，在20 μmol/L浓度下，PtNPs引起质粒的有效丢失。且实验证明，该纳米颗粒是无毒的。机理研究表明，纳米颗粒与细胞表面相互作用，扰乱了细胞内膜的完整性，并且可以引起质粒DNA的裂解，进而导致质粒丢失，使多重耐药细菌在体内恢复对抗菌剂的敏感性。

尽管金属纳米颗粒是另一种对抗细菌耐药性的武器，但由于金属在动物饲料添加剂和消毒剂生产等领域的使用，细菌也能够对纳米颗粒产生耐药性。由于纳米颗粒使用剂量较低，尽管它们对身体无害，然而，纳米颗粒在人体内长时间存在可能会造成生物积累[49]。因此，需要对纳米颗粒的长期毒性和致癌性进行进一步的研究。

2.4 中草药

中药作为一种天然药物，来源广泛，安全性高，毒副作用小。且许多中草药不仅具有抑菌、杀菌作用，还被发现具有逆转细菌耐药性的作用。刘彦晶等[50]以亚抑菌浓度的黄芩醇提剂和水煎剂作为消除剂对乙酸钙不动杆菌的NDM-1质粒进行消除试验，结果显示，黄芩醇提剂和水煎剂均可导致质粒的丢失，其中醇提剂的消除效率更高。彭苗苗[51]以七种单味中药黄连、柴胡、大黄、鱼腥草、板蓝根、穿心莲及黄柏对临床分离的猪源大肠埃希菌进行耐药质粒消除试验。实验发现，七种单味中药均具有耐药质粒消除作用，且黄连的消除效果最佳。综上所述，中草药可以在体外有效地消除质粒，然而由于中草药具有复杂的成分，还需要更多的研究来确认其作用机制，及确定有无毒性和体内有效性。

3 生物消除方法

3.1 转座子消除

利用转座子消除质粒的基本原理是通过插入细菌携带的质粒，引入具有自杀特性的基因。例如，消除携带抗性基因的质粒，其突变株应表现为对此抗性敏感等。目前应用于质粒消除研究的转座子包括Tn5[52]、Tn5-rpsL[53]、Tn10[54]和Tn1-amp[55]等。胡国元等[56]用Tn5-mob-sacB 标记根瘤菌携带的质粒，使其获得对蔗糖敏感的基因。将菌株置于含有7%蔗糖的培养基上于28 ℃培养，经过筛选获取质粒丢失的突变菌株。

3.2 质粒不相容性消除

质粒不相容性是指同一种或者亲缘关系相近的两种质粒不能在同一细胞中同时稳定存在的现象。通过引入另一个相同复制子，干扰菌株中原始质粒的复制，使质粒在多次传代过程中造成丢失。质粒不相容已广泛用于质粒消除，可成功消除芽孢杆菌属中的一些质粒，如苏云金芽孢杆菌[57]和炭疽芽孢杆菌[58]。Tian等[59]通过构建不相容质粒pBV02，后将其导入贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）NSZ-YBGJ001中，在含25 μg/mL卡那霉素的培养基中连续多次传代，最终消除质粒pBV01。Kamruzzaman等[60]利用质粒不相容性，构建了与编码抗毒素和复制子的基因相结合的干扰质粒。在干扰质粒的存在下，可以有效消除体外培养肠杆菌科细菌中编码blaIMP-4和blaCMY-2基因的质粒，以及小鼠肠道内定殖的大肠埃希菌中的目标质粒，使整个肠道微生物群可以恢复对抗生素的敏感性，而不会产生任何新的抗生素耐药性。该研究表明，利用不相容质粒，可以在体外和小鼠肠道中实现安全、彻底消除细菌的抗生素耐药性。这种方法的质粒消除效率高，且避免了使用化学消除方法时产生的毒性，但其主要缺点是在质粒消除前必须详细了解菌株靶质粒的复制类型[61-62]，适用于对菌株靶质粒信息较清楚的质粒消除实验。且目前尚不清楚该方法是否适用于不同宿主物种中的微生物群，因此需要进行深入的研究，以克服该系统的局限性。

3.3 基于CRISPR/Cas系统消除法

近年来，科研人员已经探索了CRISPR/Cas系统作为质粒消除的可行性。CRISPR/Cas系统是细菌体内一种天然免疫系统，是重要的基因编辑工具之一。抗生素抗性细菌可以通过使用CRISPR-Cas9系统特异性切割抗性基因或质粒来恢复其对抗生素的敏感性。Hao等[63]开发了一种新型的CRISPR/Cas9介导的pCasCure质粒消除系统，以消除临床肠杆菌目细菌分离物中的碳青霉烯酶基因和质粒。该系统将pCasCure质粒转移到临床耐药肠杆菌分离株中，靶向目标质粒后，可高效去除碳青霉烯酶基因和质粒，并使其恢复对碳青霉烯的敏感性。Wang等[64]通过建立pMBLcas9-sgRNA质粒成功消除了临床大肠埃希菌分离株14EC007中的2个原生质粒，从而使分离株14EC007对多黏菌素和羧苄青霉素重新敏感。

CRISPR-Cas系统在临床治疗方面有着巨大潜力，但目前的开发仍处于初级阶段，进一步的工作需要将CRISPR/Cas元件整合到一个最佳的输送系统中，使其适用于临床应用。噬菌体被认为是递送CRISPR-Cas元件的理想载体，但这种方法仍存在一些局限性。大多数噬菌体的宿主范围较窄[65-66]，且将较大的CRISPR-Cas元件整合到噬菌体基因组中可能会影响噬菌体自身的复制和组装[67]。其次，噬菌体可以传递宿主的DNA片段，在噬菌体介导的水平基因转移下，将会引发传播毒力因子或耐药基因的安全问题[68]。一些研究试图使用接合法将CRISPR/Cas9质粒递送到受体细菌中，但是转移效率都较低。目前，虽然大多数研究证明了CRISPR系统可用于体外消除耐药质粒，但其体内的有效性尚未得到验证。此外，如何将其运输到细胞内病原体的靶点是另一个重大挑战。

4 展望

抗生素耐药性是对公共健康和环境的重大威胁，寻找有效和安全的消除质粒的方法对减轻细菌耐药性至关重要。虽然已知的一些消除耐药质粒的方法不适用于临床耐药细菌感染的治疗，但可以应用于环境污染处理。例如，可以将质粒消除剂应用于养殖场、医疗废水、土壤中，减少耐药基因对环境中的污染，从而减缓耐药性的传播。可移动元件在耐药基因的获取和传播中起着关键作用，因此控制耐药性的一种方法就是限制可移动元件的转移。尽管有很多基于物理、化学方法到基于不相容性或CRISPR/Cas的方法可以消除质粒，但是目前还没有一个较好的可供体内使用的消除质粒的方法，因此需要进一步的研究以发现安全有效的方法来消除质粒，并在未来的临床应用中防止抗生素耐药基因的传播。

参 考 文 献

Browne A J， Chipeta M G， Haines-Woodhouse G， et al. Global antibiotic consumption and usage in humans， 2000-18： a spatial modelling study[J]. Lancet Planet Health， 2021， 5（12）： e893-e904.

Zhang Q Q， Ying G G， Pan C G， et al. Comprehensive evaluation of antibiotics emission and fate in the river basins of China： source analysis， multimedia modeling， and linkage to bacterial resistance[J]. Environ Sci Technol， 2015， 49： 6772-6782.

Van Boeckel T P， Glennon E E， Chen D， et al. Reducing antimicrobial use in food animals[J]. Science， 2017， 357： 1350-1352.

Frost L， Leplae R， Summers A， et al. Mobile genetic elements： the agents of open source evolution[J]. Nat Rev Microbiol， 2005， 3： 722-732.

Bennett  P M. Plasmid encoded antibiotic resistance： acquisition and transfer of antibiotic resistance genes in bacteria[J]. Br J  Pharmacol， 2008，153（Suppl.1）： S347-S357.

Pruden A， Arabi M， Storteboom H N. Correlation between upstream human activities and riverine antibiotic resistance genes[J]. Environmental Science  Technology， 2012， 46（21）： 11541-11549.

Udikovic Kolic N， Wichmann F， Broderick N A， et al. Bloom of resident antibiotic-resistant bacteria in soil following manure fertilization[J]. Proceedings National Academy  Sciences USA， 2014， 111： 15202-15207.

Naas T， Oueslati S， Bonnin RA， et al. Beta-lactamase database （BLDB） – structure and function[J]. Enzyme Inhib Med Chem， 2017， 32：917-919.

Yong  D， Toleman M A， Giske C G， et al. Characterization of a new metallo-lactamase gene， blaNDM-1， and a novel erythromycin esterase gene carried on a unique genetic structure in Klebsiella pneumoniae sequence type 14 from India[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2009， 53：5046 -5054.

Wu W， Feng Y， Tang G， et al. NDM metallo-β-lactamases and their bacterial producers in health care settings[J]. Clin Microbiol Rev， 2019， 32（2）： e00115-18.

Dortet  L， Poirel  L， Nordmann  P. Worldwide dissemination of the NDM-type carbapenemases in Gram-negative bacteria[J]. Biomed Res Int， 2014：249856.

Liu Y Y， Wang Y， Walsh T R， et al. Emergence of plasmid-mediated colistin resistance mechanism MCR-1 in animals and human beings in China： a microbiological and molecular biological study [J]. Lancet Infect Dis， 2016， 16（2）： 161-168.

Shen Y， Zhou H， Xu J， et al. Anthropogenic and environmental factors associated with high incidence of mcr-1 carriage in humans across China[J]. Nat Microbiol， 2018， 3（9）： 1054-1062.

Wang  R， van Dorp L， Shaw L P， et al. The global distribution and spread of the mobilized colistin resistance gene mcr-1[J]. Nat Commun， 2018， 9（1）： 1179.

Laubt T， Malkus P， Paulsson J. New quantitative methods for measuring plasmid loss rates reveal unexpected stability[J]. Plasmid， 2013， 70（3）：353-361.

Mesas J M， Rodriguez  M C， Alegre M T. Plasmid curing of Oenococcus oeni[J]. Plasmid， 2004， 51（1）： 37-40.

Klassen R， Meinhardt  F. Linear plasmids pWR1A and pWR1B of the yeast Wingea robertsiae are associated with a killer phenotype[J]. Plasmid， 2002， 48（2）： 142-148.

Berzin V， Kiriukhin M， Tyurin M. “Curing” of plasmid DNA in acetogen using microwave or applying an electric pulse improves cell growth and metabolite production as compared to the plasmid-harboring strain[J]. Archives of Microbiology， 2013， 195（3）： 181-188.

El-Mansi  M， Anderson K J， Inche  C A， et al. Isolation and curing of the Klebsiella pneumoniae large indigenous plasmid using sodium dodecyl sulphate [J]. Research in Microbiology，  2000， 151（3）： 201-208.

朱美秋，杜克久. LBA4404中的质粒消除与筛选[J]. 河北林业科技， 2014， （2）： 1-4.

Paul  D， Chanda D D， Chakravarty A， et al. An insight into analysis and elimination of plasmids encoding metallo-β-lactamases in Pseudomonas aeruginosa[J]. J Global Antimicrobial Resistance， 2020， 21： 3-7.

Aksoy D， ?en E. Determination of the role of Salmonella enterica plasmids in antibiotic susceptibility and Caenorhabditis elegans pathogenicity [J]. Mikrobiyoloji bulteni， 2018， 52（1）： 80-88.

Yeldho D， Rebello S， Jisha M S. Plasmid-mediated biodegradation of the anionic surfactant sodium dodecyl sulphate， by Pseudomonas aeruginosa S7 [J]. B Environ Contam Tox， 2011， 86（1）： 110-113.

Saranathan R， Sudhakar P， Karthika R U， et al. Multiple drug resistant carbapenemases producing Acinetobacter baumannii isolates harbours multiple R-plasmids [J]. Indian Journal of Medical Research， 2014， 140（2）： 262-270.

Saglam H， Karahan A G. Plasmid stability of potential probiotic lactobacillus plantarum strains in artificial gastric juice， at elevated temperature， and in the presence of novobiocin and acriflavine[J]. Archives  microbiology， 2021， 203（1）： 183-191.

Dhanarani T S， Shankar C， Park J， et al. Study on acquisition of bacterial antibiotic resistance determinants in poultry litter [J]. J  Poultry Science， 2009， 88（7）： 1381-1387.

Voros A， Simm R， Kroeger  J K， et al. Gene transcription from the linear plasmid pBClin15 leads to cell lysis and extracellular DNA-dependent aggregation of Bacillus cereus ATCC 14579 in response to quinolone-induced stress [J]. Microbiology， 2013， 159（11）： 2283-2293.

Sun Y， Liu Q， Chen S， Song Y， et al. Characterization and plasmid elimination of NDM-1-producing Acinetobacter calcoaceticus from China [J]. PLoS One，  2014， 9（9）： e106555.

Amaral  L， Viveiros M， Molnar J. Antimicrobial activity of phenothiazines [J]. In Vivo， 2004， 18（6）： 725-731.

Ordway D， Viviros M， Leandro  C， et al. Clinical concentrations of thioridazine kill intracellular multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2003， 47（3）： 917-922.

Spengler E R G， Molnar A， Schei Z Z， et al. The mechanism of plasmid curing in bacteria[J]. Current Drug Targets， 2006， 7： 823-841.

Molnar J. Antiplasmid activity of tricyclic compounds[J]. Methods and findings in experimental and clinical pharmacology， 1988， 10（7）： 467-474.

Molnar J， Foldeak S， Nakamura M J， et al. Antiplasmid activity： loss of bacterial resistance to antibiotics[J]. APMIS. Supplementum， 1992， 30： 24-31.

Molnar J， Mandi Y， Foldeak S. Drug-receptor interaction on plasmid elimination by phenothiazines and imipramine in Escherichia coli[J]. Acta microbiologica Academiae Scientiarum Hungaricae， 1982， 29（1）： 17-25.

Costa S S， Ntokou E， Martins A， et al. Identification of the plasmid-encoded qacA efflux pump gene in meticillin-resistant Staphylococcus aureus （MRSA） strain HPV107， a representative of the MRSA Iberian clone [J]. Int J Antimicrob Ag， 2010， 36（6）： 557-561.

Molnar J， Bathon N， Csik V， et al. Interaction between tricyclic psychopharmacons and some antibiotics[J]. Acta microbiologica Academiae Scientiarum Hungaricae， 1995， 42： 277-285.

Wolfart K， Spengler G， Kawase M， et al. Synergistic interaction between proton pump inhibitors and resistance modifiers： promoting effects of antibiotics and plasmid curing[J]. In Vivo， 2006， 20（3）： 367-72.

Brandi L， Falconi M， Ripa S. Plasmid curing effect of trovafloxacin [J]. FEMS Microbiology Letters， 2000， 184（2）： 297-302.

Mchugh G L， Swartz M N. Elimination of plasmids from several bacterial species by novobiocin [J]. Antimicrob Agents Chemother， 1977， 12（3）： 423-6.

Huys G， Dhaene K， Swings J. Genetic basis of tetracycline and minocycline resistance in potentially probiotic Lactobacillus plantarum strain CCUG 43738 [J]. Antimicrob Agents Chemother， 2006， 50（4）：1550-1551.

Gado I， Toth I， Szvoboda G. Curing of plasmid pE194 with novobiocin and coumermycin A1 in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus [J]. Zentralblatt fur Bakteriologie， 1987， 265（1-2）： 136-145.

高枫，梁继新，刘保勤，等.头孢类药物对人体大肠杆菌耐药性质粒消除作用的探讨[J].河南医药信息，2001， （18）：14-15.

Riber L， Burmolle M， Almm M， et al. Enhanced plasmid loss in bacterial populations exposed to the antimicrobial compound irgasan delivered from interpenetrating polymer network silicone hydrogels [J]. Plasmid， 2016， 87-88.

Bavya M C， Vimal Rohan K， Gaurav G B， et al. Synergistic treatment strategies to combat resistant bacterial infections using schiff base modified nanoparticulate - hydrogel system [J]. Mat Sci Eng C-Mater， 2019， 95： 226-235.

Lakshmi V V， Sridhar P， Khan B T， et al. Mixed-ligand complexes of platinum（Ⅱ） as curing agents for pBR322 and pBR329 （ColE1） plasmids in Escherichia coli [J]. J General Microbiology， 1988， 134（7）： 1977-1981.

Antonoglou O， Lafazanis K， Moudikoudis S， et al.  Biological relevance of CuFeO2 nanoparticles： antibacterial and anti-inflammatory activity， genotoxicity， DNA and protein interactions [J]. Mat Sci Eng C-Mater， 2019， 99： 264-274.

Bozkir A， Saka O M. Chitosan-DNA nanoparticles： effect on DNA integrity， bacterial transformation and transfection efficiency [J]. J  Drug Targeting， 2004， 12（5）： 281-288.

Bharathan S， Sundaramoopthy N S， Chandrasekaran H， et al. Sub lethal levels of platinum nanoparticle cures plasmid and in combination with carbapenem， curtails carbapenem resistant Escherichia coli [J]. Scientific Reports， 2019， 9（1）： 5305.

Hasan A， Morshed M， Memic A， et al. Nanoparticles in tissue engineering： applications， challenges and prospects [J]. International Journal of Nanomedicine， 2018， 13： 5637-5655.

刘彦晶， 张雅洁， 纪雪， 等. 中药黄芩对NDM-1乙酸钙不动杆菌的抑菌及质粒消除的研究[J].中国药学杂志， 2017， 52（12） ： 1018-1022.

彭苗苗. 中药对猪源大肠杆菌耐药性消除作用的研究[D]. 长沙：湖南农业大学， 2017.

Barretoe F， Staliotto R， Baldanig I. Curing of a non-symbiotic plasmid of the Rhizobium tropici strain CIAT 899 affected nodule occupancy and competitiveness of the bacteria in symbiosis with common beans[J]. European J Soil Biology， 2012， 50： 91-96.

Imre A， Olasz F， Kiss J. A novel transposon-based method for elimination of large bacterial plasmids [J]. Plasmid， 2006， 55（3）： 235-241.

Crosa J H， Hodges LL， Schiewe M H. Curing of a plasmid is correlated with an attenuation of virulence in the marine fish pathogen Vibrio anguillarum[J]. Infect  Immun， 1980， 27（3）： 897-902.

Ni B， Du Z， Guo Z， et al.  Curing of four different plasmids in Yersinia pestis using plasmid incompatibility[J]. Letters in Applied Microbiology， 2008， 47： 235-240.

胡国元， 周俊初. 华癸中生根瘤菌质粒消除方法研究进展[J].化学与生物工程， 2006， 3：7-9.

Wang P， Zhu Q， Shang H， et al. Curing of plasmid pBMB28 from Bacillus thuringiensis YBT-020 using an unstable replication region[J]. J Basic Microbiology， 2016， 56（2）： 206-210.

Wang  H， Liu  X， Feng  E， et al. Curing the plasmid pXO2 from Bacillus anthracis A16 using plasmid incompatibility[J]. Curr Microbiol， 2011， 62：703–709.

Tian H， Liu B， Yang J， et al. Genetic transformation system for Bacillus velezensis NSZ-YBGJ001 and curing of the endogenous plasmid pBV01[J]. Biotechnol Lett. 2021， 43（8）： 1595-1605.

Kamruzzaman M， Shoma S， Thomas C M， et al. Plasmid interference for curing antibiotic resistance plasmids in vivo[J].PLoS One， 2017， 12： e0172913.

Liu X， Wang D， Wang H， et al. Curing of plasmid pXO1 from Bacillus anthracis using plasmid incompatibility[J]. PloS One， 2012， 7（1）： e29875.

Cao M， Geng W， Liu L， et al. Glutamic acid independent production of poly-γ-glutamic acid by Bacillus amyloliquefaciens LL3 and cloning of pgsBCA genes[J]. Bioresource Technology， 2011， 102（5）： 4251-4257.

Hao M， He Y， Zhang H， et al. Crispr-cas9-mediated carbapenemase gene and plasmid curing in carbapenem-resistant Enterobacteriaceae[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2020， 64（9）： e00843-20.

Wang P， He D， Li B， et al. Eliminating mcr-1-harbouring plasmids in clinical isolates using the CRISPR/Cas9 system[J].  J Antimicrobial Chemotherapy， 2019， 74（9）： 2559-2565.

Dupont K， Vogensen F K， Neve H， et al. Identification of the receptor-binding protein in 936-species lactococcal bacteriophages[J]. Appl. Environ Microbiol， 2004， 70， 5818–5824.

Chatterjee S， Rothenberg E. Interaction of bacteriophage l with its E. coli receptor， LamB[J]. Viruses， 2012， 4， 3162–3178.

Hua J， Huet A， Lopez C A， et al. Capsids and genomes of jumbo-sized bacteriophages reveal the evolutionary reach of the HK97 fold[J]. MBio， 2017， 8： e01579-01517.

Pirnay J P， Blasdel B G， Bretaudeau L， et al. Quality and safety requirements for sustainable phage therapy products[J]. Pharm Res， 2015， 32（7）： 2173-2179.

收稿日期：2022-09-22

基金项目：“十三五”国家重点研发计划项目（2017YFC1600100）。

作者简介：刘泉，硕士研究生，主要从事抗菌药耐药研究。

*通讯作者：戴梦红，副教授，主要从事抗菌药耐药研究。