密毛山梗菜内生放线菌的分离、鉴定及对香蕉枯萎病的防效

杨李玲+陈宇丰+周登博+高祝芬+黄绵佳+张锡炎

摘要：从我国云南地区采集药用植物密毛山梗菜（Lobelia clavata E.Wimm.）植株为样品，采用稀释涂布平板法进行内生放线菌的分离，以香蕉枯萎病菌4号小种为靶标菌，通过平板对峙试验，筛选出对尖孢镰刀菌菌丝生长抑制作用最强的生防菌株2株，通过形态观察、生理生化特性比对并结合 16S rDNA 序列分析对这2种菌株进行鉴定，采用滤纸片扩散法测定其内生放线菌次生代谢产物对感病香蕉的抑菌活性。结果表明：经鉴定DJ15菌株为Streptomyces yatensis，XLG-1 菌株为Streptomyces celluloflavus（纤维黄链霉菌），这2种菌株对香蕉枯萎病菌菌丝抑制率分别为 5446%、 7012%。所分离的菌株对多种植物病原真菌均有抑制效果，为无环境公害型微生物资源的研究与应用奠定基础。

关键词：密毛山梗菜；内生放线菌；香蕉枯萎菌；鉴定；次生代谢产物；抗菌活性

中图分类号： S436.68+1文献标志码：

文章编号：1002-1302（2016）08-0199-04

密毛山梗菜（Lobelia clavata E.Wimm.）为半边莲科半边莲属植物，民间用于治疗腮腺炎、跌打损伤、风湿痛、疹症，全草或根、叶（有毒）药用，分布于云南西南部至南部。其提取物中分离的齐墩果酸存在于许多中草药中，生理活性较为广泛，对其结构修饰后合成的齐墩果酸磷酸醋单钠，经体外药理试验证实，其抗肿瘤活性比齐墩果酸高5倍[1-2]。

香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. cubense，简称Foc）侵染而引起的危害香蕉生产的毁灭性土传真菌病害，该病可导致植物茎叶萎蔫，严重时整株枯死，是世界上分布最广、危害最大、造成损失最严重的植物土传病害之一[3]。为了减少化学肥料和农药的使用，应用生物防治方法对香蕉枯萎病进行综合防控已成为国内外的研究热点[4]。戴青冬等对抗香蕉枯萎病生防菌进行了筛选及生防效应方面的研究[5]。胡伟等报道了添加生防菌株解淀粉芽孢杆菌的生物有机肥在不同耕作模式下对香蕉生长和香蕉枯萎病防治效果的影响，发现这种菌株有机肥能降低香蕉枯萎病病情指数[6]。目前防治香蕉枯萎病的生防菌株主要有以下几大类：生防细菌、生防真菌、生防放线菌等[7-9]。本研究以云南密毛山梗菜作为试验材料，分离出2株对香蕉枯萎病菌具有较好拮抗效果的内生放线菌DJ15、XLG-1。通过形态观察、生理生化特性比对并结合 16S rDNA 序列分析对该菌株进行鉴定，对其进行抗菌活性和次级代谢产物活性进行研究，为其今后应用于香蕉枯萎病的防治提供理论指导。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1样品采集密毛山梗菜植株樣品采集于云南省西双版纳植物园（地理位置109°51′17″E、19°47′1″N），样品分为根、茎、叶3份，采集后混匀，置于无菌封口袋中，封口，放入冰盒中保存，带回实验室在4 ℃冰箱中保存备用。

1.1.2主要试剂采用北京百泰克生物技术有限公司生产的细菌DNA 提取试剂盒，北京博迈德生物公司生产的Taq DNA聚合酶，爱思进生物技术有限公司生产的PCR产物纯化试剂盒；引物合成、测序由华大基因完成。

1.1.3供试病原菌本研究筛选拮抗菌所用病原菌为香蕉枯萎病菌4号小种（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）。放线菌多抗性测试病原菌有香蕉长形斑病原菌（Curvularia fallax）、香蕉大灰斑病原菌（Curvularia lunata）、香蕉炭疽病原菌（Colletotrichum musae）、草莓炭疽病原菌（C. fragariae）、辣椒炭疽病原菌（C. acutatum）、胶孢炭疽病原菌（C. gloeosporioides）、香蕉树木溃疡病原菌（Botoryosphaeria dothidea）、贡蕉烟头病原菌（Fusarium spp.）、香蕉叶缘枯斑病原菌（Alternaria musae）。此外，还有灰葡萄孢菌病原菌（Botrytis cinerea）等。菌源均由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所提供。

1.1.4供试培养基采用高氏一号培养基进行分离，灭菌后在1 L培养基中加入3 mL经过过滤除菌处理的1%重铬酸钾溶液、0.5 mL 5%制霉菌素；采用酵母膏麦芽膏琼脂培养基纯化菌株、保藏，同时进行形态观察；采用PDA培养基进行平板对峙培养；采用酵母膏麦芽膏（YE）液体培养基进行菌株发酵。

1.2内生放线菌的分离

具体分离方法参照文献[10]。

1.3拮抗放线菌的筛选

具体筛选方法参照文献[11]。

1.4菌株鉴定

1.4.1形态与培养特征观察具体方法参照文献[12-14]。

1.4.2生理生化特征具体方法参照文献[15]。

1.4.3系统发育学特征用细菌DNA 提取试剂盒提取样品DNA；采用细菌通用引物（27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，1492R：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACT-3′）进行16S rDNA的PCR扩增；产物纯化后测定基因序列；采用EzTaxon与GenBank搜索序列相似性，选取相似性最高的模式菌序列，用MEGA5.0中的邻接法（Neighbor-Joining，N-J）法比较同源性，构建系统进化树。

1.5菌株抗菌活性评价

1.5.1平板对峙对病原菌的拮抗作用将拮抗放线菌与香蕉炭疽病菌等11种病原真菌于28 ℃对峙培养7～14 d，以不接拮抗菌的平板为对照，每个处理3次重复，以抑菌带宽度来衡量菌株对病原真菌的抑制作用。

1.5.2混合菌液对病原菌的拮抗作用以及对病原菌菌丝生长、分生孢子萌发的抑制作用具体方法参照文献[16-17]。

1.5.3次生代谢产物对病原菌的抑制作用具体方法参照文献[18-19]。

1.6数据处理

采用SAS 6.12软件进行方差分析及多重比较。

2结果与分析

2.1放线菌的分离与筛选

根据分离的菌株在纯化培养基上的菌落形态及颜色去重，获得126株放线菌；经过平板对峙培养法筛选后，得到产生抑菌圈最大的2株放线菌，分别编号为DJ15、XLG-1。

2.2菌株DJ15、XLG-1的分类鉴定

2.2.1形态特征菌株DJ15的基内菌丝发达、不断裂，气生菌丝多分枝，孢子丝波曲状，孢子呈椭圆形，表面光滑。

2.2.2培养特征菌株DJ15、XLG-1在供试的7种培养基上生长良好，其菌落形态特征见表1。

2.2.4系统发育学特征将所获得的DJ15、XLG-1菌株的16SrDNA序列通过EzTaxon与GenBank上登录的序列进行基因序列相似性比对，得到21株分别与菌株DJ15、XLG-1同源性最高、已定名的模式菌的序列信息，MEGA5.0软件构建系统发育树如图1所示，可见DJ15菌株与Streptomyces yatensis NBRC 101000T （AB249962）同源性最高，可达99.96%；XLG-1菌株与Streptomyces kasugaensis M338-M1T （AB024441）、Streptomyces celluloflavus NRRL B-2493T （JOEL01000102）2株菌同源性最高，均为99.09%，且均处于同一分支。结合形态特征、培养特征和生理生化特征比对，鉴定DJ15菌株为Streptomyces yatensis，XLG-1菌株为Streptomyces celluloflavus（纤维黄链霉菌）。

2.3菌株抗菌活性评价

2.3.1菌株抑菌谱测定平板对峙试验结果（表3） 表明，菌株DJ15、XLG-1抑菌效果较广，对供试的11种植物病原真菌菌丝的抑制率均超过50%，具有较好的抑制效果。2种菌株对病原真菌抑制作用中，XLG-1对贡蕉烟头病原菌的抑制率为74.99%，抑菌带宽度达到2.16 cm，抑制作用最强。除了DJ15对香蕉长形斑病原菌、灰葡萄孢菌原菌、草莓炭疽病原菌及香蕉炭疽病原菌的抑菌带宽度小于1.5 cm， 其余的

2.3.2次生代谢产物对分生孢子萌发的抑制作用菌株DJ15、XLG-1不同浓度的发酵液对香蕉枯萎病菌4号小种分生孢子的萌发具有不同程度的抑制作用，发酵液原液的抑制率最高，10%发酵液抑制率则最低，发酵滤液浓度增加至50%时，病原菌孢子的裂解增加（表4），說明随着拮抗菌发酵滤液浓度增加，滤液对病原菌孢子的生长抑制作用也增强。

2.3.3次生代谢产物对病原菌的抑制作用菌株DJ15、XLG-1的发酵产物对11种供试植物病原真菌都有较好的抑制效果（表5）。其中DJ15对香蕉树木溃疡病原菌的抑制作用最强，抑菌带宽度达到2.11 cm；XLG-1对贡蕉烟头病原菌的抑制作用作用最强，抑菌带宽度达到2.62 cm；2种菌株对香蕉枯萎病4号小种均有较强的抑制作用，抑菌带宽无明显差异性，分别为1.99、2.40 cm。

3讨论和结论

随着人们对生态环境的日益重视，目前利用生防菌防治香蕉枯萎病病害已是国内外学者研究的重要内容，但是由于微生物定殖能力不强，容易受湿度、温度、化学农药和其他环境因素的影响，导致生物防治的效果不稳定，从而限制了微生

戴青冬等通过对香蕉进行施用BLG01、BDF11与有机液肥的试验，筛选出高效生防枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis BLG01和BDF11，这2种菌株对香蕉枯萎病病原菌的抑制率最高可达77%[5]。然而从植株内尤其是药用植物内分离筛选出的微生物用于香蕉枯萎病的防治却鲜有报道。本研究中，从药用植物密毛山梗菜中分离筛选鉴定出的菌株，对香蕉枯萎病菌在内的11种病原菌具有广谱抗性，特别是对香蕉枯萎病菌菌丝生长抑制率分别达54.46%、70.12%，抑制效果良好。原因可能是这些生防菌能抑制病原菌，降低土壤中的尖孢镰刀菌数量，使病害得到了有效控制[5]。由于内生菌生长于植株内，不易受外界环境影响，具有可以在植物体内定殖和运转的特殊性质[25]，按照内共生理论，内生菌可能产生与其宿主相同或相似的代谢产物，因此从药用植物中分离具有抗菌活性放线菌，成为病害生物防治中具有潜力的微生物农药。

谭力等通过对银杏内生放线菌进行研究，发现由分离、筛选得到具有抑菌作用的菌株KLBMP 5501为浅紫链霉菌Streptomyces violascens[20]。本研究从密毛山梗菜体内分离到2株对香蕉枯萎病菌4号小种拮抗作用较强的菌株DJ15、XLG-1，通过形态观察、生理生化测定及16S rDNA 序列分析，鉴定出DJ15菌株为Streptomyces yatensis，XLG-1菌株为纤维黄链霉菌（Streptomyces celluloflavus），目前还未发现2株菌应用于土传病害防治方面的报道。同时该菌株发酵滤液对香蕉枯萎病菌4号小种的孢子萌发抑制率随着稀释浓度变化而变化，其中原液对香蕉枯萎病菌4号小种的孢子萌发抑制率最大，分别为84.44%、89.10%，表明该菌株的次生代谢产物含有抑菌物质，值得对DJ15、XLG-1菌株在植物病害的防治、抗生素的分离纯化及其抑菌机理等方面进行深入研究。目前，从密毛山梗菜中分离得到的内生放线菌应用于防治植物病害的研究尚未见报道，因此开展对DJ15、XLG-1菌株在植株体内定殖、田间应用、次生代谢产物的分离、生防菌剂的研制等方面作深入研究具有一定的实践意义，为进一步优化提高抑菌活性以及后期大田生物防治提供科学依据。

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