模糊数学耦合响应面法优化椰浆发酵乳的品质

孙泽荟，李杰，钮小童，马晓，于晶阳，刘宇杰

山东农业大学食品科学与工程学院（泰安 271018）

随着人们对健康重视程度的不断深化，人们追求着更加平衡的膳食模式，对健康食品的需求也日益凸显[1]。酸奶因其具有改善肠胃、预防心血管疾病等保健功效[2-4]，从而受到广大消费者的喜爱。如今，消费者正努力寻求口味和健康之间的平衡，不含胆固醇和乳糖的植物型发酵乳不仅其产品质构特性与动物型发酵乳基本相同，并且口感顺滑，更易被人体吸收，从而受到乳糖不耐受者和健康食品消费人群的喜爱[5-7]。

椰浆中含有丰富的中链脂肪酸[8]，在食物中以中链甘油三酯的形式存在，可以快速产生能量却又不易转化为脂肪，有助于快速能量补给和促进运动疲劳恢复[9]，并且具有良好的抗真菌、抗氧化、降血糖、降血压、抗炎及抗肿瘤等营养特性和药用价值[10-13]，由此选用椰浆作为发酵原料。

赤藓糖醇因其具有热量低、无致龋齿性、无吸湿性、耐消化性等功能特点[14]，受到越来越多消费者的青睐。研究表明，赤藓糖醇在酸性环境下具有稳定性，在提高甜度、厚重感、滑润感及降低苦涩感方面有显著作用[15-16]，因此通过探究赤藓糖醇添加量对椰浆发酵乳品质的影响以优化现有椰浆发酵乳的加工工艺。

在实际应用中发现，易被主观因素干预的传统感官品评法，存在感官评价界定不准确的弊端，约束对椰浆发酵乳的准确量化评价[17-18]。试验依靠模糊数学理论，构建模糊矩阵对感官评价信息进行量化评价，达到使评价结果更为精准、客观的目的[17]，从而改良椰浆植物型发酵乳的最佳工艺配方。

试验通过制备以椰浆为主料植物型发酵乳，阐述发酵乳与赤藓糖醇的量效关系，依靠模糊数学理论耦合响应面评价法，根据单因素试验及正交试验设计结果以确定添加赤藓糖醇的椰浆植物基发酵乳的最佳工艺配方，为开发新型椰浆发酵乳提供方法支持，旨在扩大椰浆发酵乳市场、丰富酸奶品种、扩宽发酵乳受众人群、增加发酵行业活力。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Kara椰浆（新加坡三务集团有限公司）；赤藓糖醇（市售）；混合发酵菌种（保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、开菲尔菌种，广东顺德尚川生物技术有限公司）。

1.2 仪器与设备

Neofuge 15R高速冷冻离心机（上海力申科学仪器有限公司）；FJ200-S均质机（力辰科技有限公司）；DHP-9162恒温发酵箱（上海一恒股份有限公司）；FE-28雷磁型pH计（梅特勒托利多有限公司）；UV-5200型紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；BC-71JA冰箱（浙江星星家电股份有限公司）；HT-3磁力搅拌器（常州国华电器有限公司）；HH-6数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）。

1.3 工艺流程

预处理→巴氏杀菌→冷却→接种→发酵→后熟→品质监控

1.4 操作要点

1.4.1 预处理

将新鲜椰浆高压均质机预热至60 ℃，在20 MPa压力下进行均质。

1.4.2 巴氏杀菌

迅速置于蒸汽锅中，于60~85 ℃灭菌10~20 s。

1.4.3 接种

冷却至室温后接种混合发酵菌种。

1.4.4 发酵

于42 ℃恒温发酵培养一定时间后冷却至室温25 ℃左右。

1.4.5 后熟

将椰浆发酵乳低温保藏于4 ℃冰箱。

1.5 单因素试验

1.5.1 发酵时间

在赤藓糖醇添加量0.6%、乳酸菌接种量1%、4 ℃储藏时间4 h条件下发酵，探究在42 ℃恒温发酵时间分别为4，6，8，10和12 h时对椰浆发酵乳感官品质的影响，通过设计构建的模糊数学理论模型获得模糊数学感官评价。

1.5.2 接种量

在赤藓糖醇添加量0.6%、42 ℃恒温发酵时间10 h、4 ℃储藏时间4 h条件下发酵，探究接种混合乳酸菌分别为0.5%，1.0%，1.5%，2.0%和2.5%时对椰浆发酵乳感官品质的影响，通过设计构建的模糊数学理论模型获得模糊数学感官评价。

1.5.3 赤藓糖醇添加量

在42 ℃恒温发酵时间10 h、乳酸菌接种量1%、4 ℃储藏时间4 h的条件下发酵，探究赤藓糖醇添加量分别为0，0.2%，0.4%，0.6%和0.8%时对椰浆发酵乳感官品质的影响，通过设计构建的模糊数学理论模型获得模糊数学感官评价。

1.6 理化指标测定

1.6.1 蛋白质含量

称取0.1 g考马斯亮蓝G250溶于50 mL 95%乙醇，加入100 mL 85%（W/V）磷酸，用去离子水定容至1 000 mL并稀释，吸取1 mL待测液，加入5 mL考马斯亮蓝G250充分混合，放置2 min后，在595 nm波长处测定吸光度，根据牛血清蛋白标准曲线确定发酵乳蛋白质含量[19]。

采用牛血清蛋白作为标准蛋白质溶液制备标准曲线，如图1所示。

图1 牛血清蛋白标准曲线

1.6.2 脂肪含量[20]

称取10 g椰浆发酵乳（m）置于100 mL分液漏斗中，分别加入2.5 mL氨水、10 mL 95%乙醇混匀，加入15 mL乙醚振摇1 min、15 mL石油醚振摇1 min，静置分层。下层的残液弃去，上层的醚液通过无水硫酸钠过滤入称好质量（m1）的烧杯中，用少量无水乙醚淋洗无水硫酸钠，将烧杯置放入40~80 ℃水浴中蒸除醚液，于100 ℃干燥30 min，冷却后称重m2，酸奶的脂肪含量（mg/100 g）按式（1）计算。

式中：m为称取椰浆发酵乳总质量；m1为烧杯质量；m2为冷却后烧杯及内容物的总质量。

1.6.3 pH和酸度[21]

取10 g椰浆发酵乳于250 mL锥形瓶中，加入20 mL约20 ℃去离子水稀释。使用滴定管将氢氧化钠标准溶液加于锥形瓶中，当pH稳定于8.30±0.01处4~5 s时停止滴加。整个过程始终用磁力搅拌器进行搅拌并且在1 min内完成滴定。

1.6.4 持水力[20]

取约20 g椰浆发酵乳置于50 mL离心管中，精确称量并记录质量W1，以3 500 r/min离心（4 ℃）30 min，弃去上清液，精确称量并记录质量W2，平行测定3次，持水性按式（2）计算。

式中：W1为椰浆发酵乳置于离心管质量；W2为离心后去除上清液后质量。

1.7 感官评定

参照感官评价相关资料，设计椰浆发酵乳的感官评价标准。针对椰浆发酵乳的口感、色泽、组织状态3个方面，由10名食品专业人员（5男5女）构成的感官评价组进行百分制综合评价。

1.8 模糊数学模型的建立

根据评价标准，以色泽（x1）、口感（x2）和组织结构（x3）为指标建立评价因素集X={x1，x2，x3}；以100分为满分，90~100分为等级优，70~90分为等级良，70分以下为等级差，建立评语集V={v1，v2，v3}，具体的感官评定细则见表1。根据感官评定小组的评定结果，用模糊数学模型进行分析。

表1 酸奶的感官评分表

1.9 响应面分析试验

根据单因素的试验结果，利用响应面法分析发酵工艺中各因素对感官评分的影响及各因素间的相互影响，进行参数优化。以发酵时间、接种量、赤藓糖醇添加量为影响因素，感官评分为响应值，通过Design Expert 8.0软件，对发酵工艺进行响应面分析。设计结果如表2所示。

表2 响应面因素水平表

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 发酵时间对感官评分的影响

由图2可见，发酵时间10 h时，产品的感官评分最高。发酵时间短于10 h感官评分较低，其原因是发酵时间过短，椰浆发酵乳酸度较低，凝乳效果差，其中香气和部分营养物质受到影响。发酵时间长于10 h时，椰浆发酵乳偏酸，有轻微的乳清析出分层现象，并且发酵时间过长导致时间成本浪费。故发酵时间选取10 h。

图2 发酵时间对感官评分的影响

2.1.2 发酵剂接种量对感官评分的影响

由图3可知，椰浆发酵乳发酵剂接种量决定酸奶发酵成型时间[22]。发酵剂接种量过小，酸奶发酵时间长，组织结构松软，口感较差，无法达到酸奶酸度要求；接种量过大，则凝乳时间短，酸度高，发酵乳明显析出分层。发酵剂接种量为体积分数的1%时，感官评分最高，组织结构优良，故选取1%的发酵乳发酵剂接种量。

图3 发酵剂接种量对感官评分的影响

2.1.3 赤藓糖醇添加量对感官评分的影响

糖不仅能为菌种提供碳源，而且还是椰浆发酵乳特殊质构和风味的主要来源，如增强发酵乳的黏性，提高发酵乳的奶香味等，但过度添加会破坏椰浆发酵乳的组织状态[23]，且摄入过量的糖分会导致一系列不利于身体健康的结果[24]。因此，糖在椰浆发酵乳中的添加量尤为重要。由图4可知，随着赤藓糖醇添加量的增加，椰浆发酵乳感官评分先增加后减小，赤藓糖醇添加量0.6%时评分最高，该组产品色泽无较大差别，组织结构良好。赤藓糖醇添加量0.6%以下，口感偏酸；赤藓糖醇添加量0.8%以上时，口感甜腻。糖添加量过多时会产生高渗透压，不仅会抑制菌种的生长繁殖，降低发酵速度，还会影响发酵乳的风味口感[25]。故赤藓糖醇添加量选取0.6%。

图4 赤藓糖醇添加量对感官评分的影响

综上所述，通过单因素试验结果分析可知添加赤藓糖醇的椰浆发酵乳的发酵时间、赤藓糖醇添加量、发酵剂接种量的最佳水平分别为10 h，0.6%和1%。

2.2 感官品评试验结果

按照表1感官评价标准，10名感官评价员评定响应面试验设计中的17组椰浆发酵乳样品，获得椰浆植物型发酵乳的感官评价结果，如表3所示。

表3 椰浆植物型发酵乳感官评价结果

2.3 模糊评价结果

2.3.1 确定质量因素权重集

用k=（k1，k2，k3，…，km）表示权重，即各因素对结果影响程度在总体因素中所占比重，所有因素的权重总和为1[23]。由感官评定小组根据个人情感倾向评价色泽、口感、组织结构3项因素在椰浆发酵乳感官评价中的重要性，按百分制打分，求出各项感官品质权重平均值，结果见表4。

表4 评价椰浆植物型发酵乳质量因素的权重分布统计

此3项质量因素权重集合为k=（k1，k2，k3）=（0.137，0.654，0.209），即影响添加赤藓糖醇的椰浆植物型发酵乳的质量指标中口感最重要，其次是组织结构，而色泽影响程度最小。

2.3.2 模糊矩阵的建立及综合评价结果

据表3中感官评定员对发酵乳的色泽、口感、组织结构3个因素分别进行评定的结果，得到椰浆植物型发酵乳的感官评价模糊关系矩阵R，按式（3）计算。

式中：j=1，2，3，…，t为样品编号，每一行为各因素评价结果。

依据矩阵公式（4）计算感官评分结果。

以第1组样品R1为例，其感官评定结果见表5。

表5 样品R1感官评价结果

由表5得到对应的模糊关系矩阵。

根据式（3）（4）进行样品R1的综合评价结果，其中

结果表明，对于42 ℃发酵时间8 h、赤藓糖醇添加量0.3 g、接种量1.5%所制备的椰浆发酵乳，55.17%的成员认为其感官为优，39.28%的成员认为其感官为良，5.55%的成员认为其感官为差。同理可得其他样品的综合评价结果。

得到结果后，对评价标准赋值（v1=95，v2=85，

同理可得其他样品的综合评价结果，如表6所示。

2.4 响应面试验分析

2.4.1 响应面优化配方

基于Box-Behnken中心组合设计理论，将发酵时间、发酵剂接种量、赤藓糖醇添加量作为自变量，以表6椰浆植物型发酵乳综合评价结果的感官评分为因变量，设计三因素三水平的响应面试验。运用Design-Expert 12软件对椰浆发酵乳感官评分试验结果进行方差分析，得到的二次多项式回归方程为：Y=91.59-0.236 3A-0.828 8B+0.240 0C-0.460 0AB-1.02AC+0.077 5BC-3.77A2-0.634 5B2-4.29C2。响应面试验方案及结果见表7，方差分析见表8。

表6 椰浆植物型发酵乳综合评价结果

表7 Box-Behnken试验设计方案及结果

从表8可知，模型P＜0.05，该模型差异显著，失拟项P=0.101 6（＞0.05），失拟项不显著，表明该模型拟合效果优良，试验误差小，因此可凭借该模型推测通过添加赤藓糖醇优化椰浆植物基发酵乳的最佳配方。

表8 回归模拟方差分析结果

从各项P值（A为0.759 0，B为0.300 0，C为0.755 4）均大于0.05则可以说明各因子对发酵乳的品质影响不显著。各因素独立对发酵乳品质产生作用，不存在因素之间对发酵乳品质的共同作用。根据各项F值（A为0.10，B为1.25，C为0.11）可以看出在所选各因素的水平范围内，对发酵乳品质影响大小的顺序为：发酵剂接种量＞赤藓糖醇添加量＞发酵时间。

由图5可知，因素对响应值影响越大响应面坡度越陡[22]，三维曲面的倾斜程度越显著，等高线交汇呈椭圆形则表明各交互因素间的交互作用明显[25]。对于椰浆发酵乳的品质，从图5（a）的弧面及等高线的变化程度可以看出，接种量和发酵时间两因素之间不存在明显相互作用。从图5（b）可得，等高线排列稀疏且形状呈现近圆形，说明赤藓糖醇添加量和发酵时间交互作用不显著。从图5（c）可得，响应面坡度较平缓，则赤藓糖醇添加量和接种量对椰浆发酵乳品质影响的交互作用不强。

图5 两两交互因素对感官评分影响的响应面及等高线图

其中从图5可以看出接种量响应面陡峭程度大于赤藓糖醇添加量和发酵时间，则说明接种量对椰浆发酵乳品质的影响最大，其次为赤藓糖醇接种量，发酵时间对椰浆发酵乳品质影响最小，与表8的方差分析结果一致，表明回归模型的可靠性和真实性。

2.4.2 最佳配方验证

结合回归模型分析结果可知，最佳工艺参数为发酵时间11.5 h、接种量0.3%、赤藓糖醇添加量0.279%，此时感官评分为89.886分。考虑到实际生产要求，改进工艺参数为发酵时间11.5 h、接种量0.5%、赤藓糖醇添加量0.6%。基于3次平行验证试验结果，得到感官评价平均分90.26分，与理论预测值基本一致，表明该添加赤藓糖醇的椰浆发酵乳配方优良。

3 结论

利用模糊数学耦合响应面法分析优化赤藓糖醇添加量对椰浆发酵乳的品质影响，得到最佳配方：发酵时间11.5 h、接种量0.5%、赤藓糖醇添加量0.6%，感官评分为90.26分。该配方发酵的椰浆发酵乳呈乳白色，光洁度高，凝固状态优良，质地均匀，酸甜适中，口感细腻，带有椰香味，满足人们对健康绿色的饮食需求。试验改善椰浆植物型发酵乳最优工艺配方，在保留其原有营养价值和保健功能[26]基础上改善椰浆发酵乳口感，从而具有广阔的发展空间和市场前景。试验仅涉及赤藓糖醇对椰浆发酵乳的感官评估和相关理化性质评价，后续可进一步探究此配方发酵的椰浆发酵乳的挥发性成分、活菌数、抗氧化能力等变化。