长茎葡萄蕨藻多酚提取工艺优化及其抗氧化性测定

牛生洋，刘强，李波，童艳梅，陈秀荔，赵永贞

1. 河南科技学院食品（新乡 453003）；2. 广西壮族自治区水产科学研究院广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室（南宁 530021）

长茎葡萄蕨藻（Caulerpa lentillifera）又名“海葡萄”，是广泛分布于热带、亚热带海域的一种暖温性大型经济绿藻[1]。其富含多糖、多酚类、氨基酸、不饱和脂肪酸、无机盐等营养成分，且比普通藻类、蔬菜类所含营养成分总量和种类都更高[2-3]。有人称长茎葡萄蕨藻在食用时口感如鱼子酱一般丰富，因此又有“绿色鱼子酱”之称[4-6]，常蘸酱调味生食、搭配海鲜凉拌，或制成高级料理。长茎葡萄蕨藻由于其安全性高，目前已经成为保健食品、药物及化妆品等领域的研究热点，在保健品市场拥有广阔的开发前景[7-8]。

研究表明，海藻中生物活性物质主要是海藻多酚，其是一类广泛存在于藻类体内的间苯三酚衍生物，可保护海藻自身免受植食性动物干扰，具有多种生物学活性[9]，尤其是抗氧化活性[10-11]。有报道指出，海藻能暴露于产生自由基和氧化剂环境中生长，就是因为其具有强大的抗氧化系统，如来自加拿大的掌状红皮藻[12]、马来西亚的总状蕨藻和匍枝马尾藻，以及法国的双歧藻和欧囊链藻[13]。然而，关于长茎葡萄蕨藻是否具有相同的生物活性物质却鲜有报道。

近年来，长茎葡萄蕨藻在我国近海渔区繁殖迅速，如果不加限制，将严重影响我国渔业生产。此次研究通过响应面法优化长茎葡萄蕨藻多酚常规提取工艺，并对其抗氧化活性进行检测，以期为长茎葡萄蕨藻的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

长茎葡萄蕨藻采于广西省防城港市国家级广西SPF南美白对虾良种场；ABTS标准品、没食子酸标品、茶多酚标品、水杨酸（北京索莱宝科技有限公司）；过硫酸钾、福林-酚试剂（上海麦克林生化有限公司）；无水乙醇（天津市大茂化学试剂厂）；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、无水碳酸钠（天津市红岩化学试剂厂）；1, 1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH）（上海化成工业发展有限公司）；硫酸亚铁（天津市科密欧化学试剂有限公司）；30%过氧化氢（成都金山化学试剂有限公司）。

1.2 试验仪器与设备

HH-4数显恒温水浴锅（金坛市杰瑞尔电器有限公司）；AR1140分析天平（深圳市时代之峰科技有限公司）；DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；G9800A酶标仪（美国Thermol公司）；多功能粉碎机JR-200（永康市松青五金厂）；H2050R台式高速冷冻离心机（长沙湘仪离心机有限公司）；RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化厂）。

1.3 试验方法

1.3.1 材料预处理

将长茎葡萄蕨藻洗净，于55 ℃烘干粉碎，过0.425 mm筛，置于干燥皿中备用。

1.3.2 长茎葡萄蕨藻多酚的提取

称取1 g长茎葡萄蕨藻粉末，在一定的料液比、乙醇体积分数、水浴温度和水浴时间下进行长茎葡萄蕨藻多酚的提取，在5 500 r/min，4 ℃条件下离心10 min，取上清液旋转蒸发，滤液用乙醇定容至100 mL容量瓶中，即得长茎葡萄蕨藻多酚提取液。

1.3.3 标准曲线的绘制

将质量浓度为0.1 mg/mL的没食子酸标准溶液分别加0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0和1.2 mL于10 mL的试管中，加入0.5 mL的福林-酚显色，5 min后加入2 mL的7.5 g/L的碳酸钠溶液，用水定容至10 mL摇匀后在暗处反应1 h，在760 nm波长下测吸光度。以没食子酸质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标建立标准曲线[14]。如图1所示，标准曲线回归方程为Y=0.115 59X+0.121 7，R2=0.999 7。

图1 没食子酸标准曲线

1.3.4 长茎葡萄蕨藻多酚提取率

用1 mL长茎葡萄蕨藻多酚代替没食子酸，余下步骤同上；通过回归方程，可得长茎葡萄蕨藻多酚质量浓度，通过式（1）可得长茎葡萄蕨藻多酚提取率。

式中：W为长茎葡萄蕨藻多酚提取率，mg/g；C为多酚质量浓度，mg/mL；V为多酚体积，mL；N为稀释倍数；w为长茎葡萄蕨藻粉末质量，g。

1.3.5 单因素试验

选取了溶剂种类、溶剂浓度、水浴时间、水浴温度、水浴次数、料液比6个单因素进行试验，根据6个因素对长茎葡萄蕨藻多酚提取率的影响程度，最终以溶剂浓度、料液比、水浴时间和水浴温度四个因素做单因素试验[15-16]。

1.3.5.1 乙醇体积分数对长茎葡萄蕨藻多酚提取率的影响

取5份1 g长茎葡萄蕨藻粉末，固定料液比1∶40 g/mL、水浴温度70 ℃、水浴时间60 min，考察乙醇体积分数40%，50%，60%，70%和80%对多酚提取率的影响。

1.3.5.2 料液比对长茎葡萄蕨藻多酚提取率的影响

取5份1 g长茎葡萄蕨藻粉末，固定乙醇体积分数70%、水浴温度70 ℃、水浴时间60 min，考察料液比1∶30，1∶35，1∶40，1∶45和1∶50 g/mL对多酚提取率的影响。

1.3.5.3 水浴时间对长茎葡萄蕨藻多酚提取率的影响

取5份1 g长茎葡萄蕨藻粉末，固定料液比1∶40 g/mL、乙醇体积分数70%、水浴温度70 ℃，考察水浴时间30，40，50，60和70 min对多酚提取率的影响。

1.3.5.4 水浴温度对长茎葡萄蕨藻多酚提取率的影响

取5份1 g长茎葡萄蕨藻粉末，固定料液比1∶40 g/mL、乙醇体积分数70%、水浴时间60 min，考察水浴温度60，65，70，75和80 ℃对多酚提取率的影响。

1.3.6 响应面优化试验

使用Design-Expert 8.0.6软件进行试验设计，以单因素试验为基础，乙醇体积分数、料液比、水浴时间和水浴温度为自变量，长茎葡萄蕨藻多酚的提取率为响应值，对长茎葡萄蕨藻多酚的提取工艺进行优化，试验因素与水平见表1。

表1 响应面试验因素及水平

1.3.7 长茎葡萄蕨藻多酚粗提物抗氧化性能测定

1.3.7.1 清除DPPH自由基能力的测定

在试管中加入2 mL新鲜配制的0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液，然后加入1.5 mL不同浓度梯度的长茎葡萄蕨藻多酚提取液，混匀后暗室反应0.5 h，在517 nm处测其吸光度A1；溶剂水代替样品的吸光度为A3；用无水乙醇替代DPPH·乙醇溶液测吸光度A2，重复3次。以茶多酚作为阳性对照，按式（2）计算DPPH自由基清除率[17-18]。

1.3.7.2 清除羟自由基能力的测定

参照范三红等[19]的方法：首先配制9 mmol/L的水杨酸、9 mmol/L的FeSO4和8.8 mmol/L的H2O2。在试管中加入2 mL的长茎葡萄蕨藻多酚，再加入水杨酸和FeSO4各1 mL，最后加2 mL的H2O2混匀，于37 ℃水浴0.5 h，在510 nm处测吸光度A1；用同体积的水代替长茎葡萄蕨藻多酚，测其吸光度A2；用同体积的水代替H2O2，测其吸光度A3。以茶多酚作为阳性对照，按式（3）计算羟自由基清除率。

1.3.7.3 清除ABTS自由基能力的测定

参照Cristina等[20]的方法：首先配制ABTS储备液、7.4 mmol/L的ABTS溶液和2.6 mmol/L的过硫酸钾溶液，等体积混合避光室温放置15 h，然后在734 nm下用pH 7.4的磷酸盐缓冲液将ABTS储备液的吸光度调为0.70左右，记为A1。将0.20 mL不同浓度的样品溶液与2 mL的ABTS稀释液混合于室温反应6 min后测定734 nm处的吸光度A2。按式（4）计算ABTS自由基清除率。

1.3.8 数据处理

试验数据采用SAS（9.1）进行统计分析，Origin 8.6（USA）作图。最后用Design-Expert 8.0.6软件对响应面试验数据进行处理。

2 试验结果

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇体积分数对长茎葡萄蕨藻多酚提取率的影响

由图2可知，随着乙醇体积分数的升高，长茎葡萄蕨藻多酚的提取率先升高后降低，最大值为0.548 2 mg/g。当乙醇体积分数大于60%后，由于极性作用会导致多酚与乙醇间的相互作用力减弱，进而使多酚提取率减小，再者，高浓度溶剂也增加了工业生产的成本，因此选取60%为乙醇提取体积分数。

图2 乙醇体积分数对长茎葡萄蕨藻多酚提取率的影响

2.1.2 料液比对长茎葡萄蕨藻多酚提取率的影响

由图3可知，随着料液比中液体占比的升高，长茎葡萄蕨藻多酚的提取率先升高后趋于稳定，在料液比1∶40 g/mL时多酚提取率达到最大值0.482 2 mg/g，之后差异不大，在节约成本的原则上，料液比选择1∶40 g/mL。

图3 料液比对长茎葡萄蕨藻多酚提取率的影响

2.1.3 提取温度对长茎葡萄蕨藻多酚提取率的影响

由图4可知，随着提取温度的升高，长茎葡萄蕨藻多酚的提取率先升高后降低，在提取温度70 ℃时达到最大值0.513 2 mg/g，之后多酚的提取率开始下降。水浴温度超过70 ℃，会使一部分不耐高温的多酚分解，反而降低了提取率。因此选择70 ℃的水浴温度为提取温度。

图4 提取温度对长茎葡萄蕨藻多酚提取率的影响

2.1.4 水浴时间对长茎葡萄蕨藻多酚提取率的影响

由图5可知，随着水浴时间的延长，长茎葡萄蕨藻多酚的提取率先升高后降低，在水浴时间50 min时多酚提取率达到最大值0.536 8 mg/g，之后随着水浴时间的增加，多酚的提取率开始下降。随着水浴时间增加，提取出来的多酚开始氧化，导致多酚提取率下降。因此选择50 min水浴时间为提取时间。

图5 水浴时间对长茎葡萄蕨藻多酚提取率的影响

2.2 响应面法优化提取工艺

2.2.1 响应面试验设计与结果

以单因素试验为基础，乙醇体积分数、料液比、水浴时间和水浴温度为自变量，长茎葡萄蕨藻多酚的提取率为响应值，对长茎葡萄蕨藻多酚的提取工艺进行优化。响应面法的试验设计与结果见表2。

表2 响应面试验设计与结果

用Design-Expert 8.0.6软件对所得试验数据进行多元回归拟合，得到二次回归方程：

Y=0.62+0.055A+0.003 133B+0.004 108C+0.002 042D+ 0.004 15AB-0.000 875AC+0.001 875AD-0.001 025BC-0.000 375BD+0.000 375CD-0.13A2-0.14B2-0.15C2-0.15D2

2.2.2 方差分析

对所得数据进行统计学分析，结果见表3：模型P＜0.000 1，说明模型差异高度显著，方程的失拟误差（P=0.256 7＞0.05）不显著，表明该回归模型对试验结果拟合较好，试验误差较小，故可用此模型对长茎葡萄蕨藻多酚提取工艺进行分析和预测。

表3 回归模型的方差分析

在试验中，一次项A对长茎葡萄蕨藻多酚提取率的影响达到极显著水平（P＜0.01），C达到显著水平（P＜0.05），B和D为不显著。交互项均为不显著，二次项A2、B2、C2、D2均为极显著，各试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系。根据显著性P值的大小可得到各因素对多酚提取率影响的顺序：乙醇体积分数（A）＞水浴温度（C）＞料液比（B）＞水浴时间（D）。

2.2.3 响应面法模型分析

响应面的陡峭程度和等高线的稀疏可以反映两个变量之间相互作用程度，响应面越陡峭，等高线越密，说明二者之间的相互作用越好[13,15]。由图6可知，乙醇体积分数与料液比（图6A）、乙醇体积分数与水浴时间（图6B）及料液比与水浴温度（图6C）的响应面曲线陡峭等高线明显，说明它们对长茎葡萄蕨藻总多酚含量的交互效应显著。

图6 多酚提取率影响的响应曲面及等高线图

2.2.4 最佳工艺预测及结果验证

通过Desige-Expert 8.0.6软件分析得到长茎葡萄蕨藻多酚提取的最佳工艺条件：乙醇体积分数60%、料液比1∶40 g/mL、提取温度70 ℃、提取时间50 min，重复3次验证该结果，得出长茎葡萄蕨藻多酚的提取率为0.632 9±0.021 mg/g，与预测值0.641 3 mg/g接近，说明该模型拟合程度较好。

2.3 长茎葡萄蕨藻多酚粗提物的抗氧化性

2.3.1 长茎葡萄蕨藻多酚粗提物清除DPPH自由基能力

长茎葡萄蕨藻多酚对DPPH自由基清除能力的结果如图7所示。随着浓度的增加，长茎葡萄蕨藻多酚对DPPH自由基的清除效果也增加，在质量浓度为120 μg/mL时，清除率达到52.81%，茶多酚在质量浓度120 μg/mL时，清除率达到91.82%。茶多酚具有活泼的羟基氢，会与DPPH自由基结合，而长茎葡萄蕨藻多酚里的羟基氢较少，所以在相同浓度下茶多酚清除DPPH自由基的能力更强。

图7 长茎葡萄蕨藻多酚清除DPPH自由基的性能

2.3.2 长茎葡萄蕨藻多酚粗提物清除羟自由基

长茎葡萄蕨藻多酚对羟自由基清除能力的结果如图8所示。长茎葡萄蕨藻多酚在低浓度时就表现出比较强的清除羟自由基的能力。在质量浓度为20 μg/mL时，长茎葡萄蕨藻多酚清除率就达到76.91%，茶多酚为47.21%；在质量浓度120 μg/mL时，长茎葡萄蕨藻多酚清除率为92.26%，茶多酚为85.72%，说明长茎葡萄蕨藻多酚具有良好的清除羟自由基的能力。

图8 长茎葡萄蕨藻多酚清除羟自由基的性能

2.3.3 长茎葡萄蕨藻多酚粗提物清除ABTS自由基

长茎葡萄蕨藻多酚对ABTS自由基清除能力的结果如图9所示。长茎葡萄蕨藻多酚在低浓度时就表现出比较强的清除ABTS自由基的能力。在质量浓度为20 μg/mL时，长茎葡萄蕨藻多酚清除率就达到68.56%，茶多酚为22.34%；在质量浓度120 μg/mL时，长茎葡萄蕨藻多酚清除率为98.04%，茶多酚为89.51%，说明长茎葡萄蕨藻多酚具有良好的清除ABTS自由基的能力。

图9 长茎葡萄蕨藻多酚清除ABTS自由基的性能

3 结论

通过响应面试验优化长茎葡萄蕨藻多酚的提取工艺，最佳条件为乙醇体积分数60%、料液比1∶40 g/mL、提取温度70 ℃、提取时间50 min，在此条件下长茎葡萄蕨藻多酚的提取率为0.632 9±0.021 mg/g。长茎葡萄蕨藻多酚对DPPH自由基的清除率低于茶多酚，对羟自由基和ABTS自由基的清除率明显高于茶多酚；在低浓度（20 μg/mL）下长茎葡萄蕨藻多酚对羟基自由基和ABTS自由基清除率分别为76.91%和68.56%，均高于茶多酚的47.21%和22.34%，说明长茎葡萄蕨藻多酚具有良好的抗氧化性，为以后分析其生物活性奠定了基础。