莪术挥发油酶法提取工艺及抗氧化活性研究

蒋德旗，莫杰梅，蒋丽林，臧青民，徐兰程，陈晓白

玉林师范学院生物与制药学院，广西高校亚热带生物资源保护与利用重点实验室，广西农产资源化学与生物技术重点实验室（玉林 537000）

莪术为姜科植物蓬莪术、广西莪术或温郁金的干燥根茎，在我国主产于广西、云南等地，其功效包括行气破血、消积止痛等[1]。莪术有效成分主要包括挥发油、姜黄素和多糖类，其中挥发油含量较多，挥发油药用活性成分为莪术醇、β-榄香烯、莪术酮等萜类化合物[2]，已被制成多种剂型，如莪术油注射液、栓剂、软膏等，临床用于抗病毒、抗菌消炎，具有较好疗效。此外，莪术还有抗肿瘤、抗氧化、抗血小板聚集等多种药理活性[2-3]。目前莪术挥发油提取主要采用水蒸气蒸馏、微波或超声辅助提取、索氏提取、超临界提取等方法[4-5]，这些方法存在提取率低、提取时间过长、需要大型设备等不足。纤维素酶可通过降解纤维素，破坏植物细胞壁，促进胞内活性成分有效溶出，提高提取率，已被用于当归、茴香挥发油提取[6-7]。研究使用纤维素酶预处理辅助提取莪术挥发油，优化其提取工艺并探究体外抗氧化活性，以期将莪术挥发油进一步开发为食品保鲜剂或保健品添加剂提供更多试验证据。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

莪术购自广西玉林中药港，经玉林师范学院陈晓白教授鉴定为姜黄属植物广西莪术（Curcuma kwangsiensis）的干燥根茎；纤维素酶（5万 U/g，北京索莱宝科技有限公司）；1, 1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；L-抗坏血酸分析标准品（上海麦克林生化科技有限公司）；柠檬酸、柠檬酸钠、硫酸亚铁、水杨酸、过氧化氢、无水硫酸钠、石油醚（国产分析纯，西陇化工股份有限公司）。

1.2 仪器与设备

FW135中药粉碎机（天津市泰斯特仪器）；5 mL挥发油提取测定器（江苏三爱思仪器设备）；98-I-B磁力搅拌电热套（菲斯福仪器）；RV-211A旋转蒸发仪（上海一恒科学仪器）；SHY-2A水浴恒温振荡器（常州国宇仪器）；FA1004B电子分析天平（上海佑科仪器仪表）；PHSJ-6L pH计（上海仪电科学仪器）；TU-1901紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器）。

2 方法

2.1 水蒸气蒸馏提取

粉碎广西莪术，过0.425 mm筛，准确称取50 g放入1 000 mL圆底烧瓶中，加10倍量蒸馏水室温浸泡12 h后，经水蒸气蒸馏4 h。蒸馏液加石油醚作为萃取剂，萃取相加无水硫酸钠静置脱水，采用减压旋蒸法去除石油醚，得到广西莪术挥发油，精密称定质量。挥发油得率=挥发油质量/莪术质量×100%。

2.2 纤维素酶辅助提取单因素试验

准确称取50 g过0.425 mm筛的莪术粉末，按料液比1∶10 g/mL加入蒸馏水，添加一定量的纤维素酶（0.5%，1.0%，1.5%，2.0%和2.5%），调节pH（4.0，4.4，4.8，5.2和5.6），分别在不同温度下（40，45，50，55和60 ℃）酶解处理一定时间（0.5，1.5，2.5，3.5和4.5 h）。单因素试验优化某一条件时，其他因素固定值分别为酶添加量1.5%、酶解pH 4.8、酶解温度50 ℃、酶解时间2.5 h，摇床速度为120 r/min。纤维素酶预处理完毕后，再按照2.1小节方法提取挥发油。

2.3 响应面优化试验

根据单因素试验结果，以酶添加量、酶解pH及酶解时间为自变量，挥发油得率为响应值，利用Box- Behnken响应面法对提取工艺进行优化，设计三因素三水平，见表1。数据分析使用Design Expert Version 13.01.0软件。

表1 响应面试验设计的因素与水平

2.4 抗氧化活性分析

莪术挥发油体外抗氧化活性检测及自由基清除率计算均参照黄培池[8]的研究方法进行。样品溶液检测前使用无水乙醇配成0.2，0.4，0.6，0.8，1.0和1.2 mg/mL不同质量浓度的系列溶液。DPPH清除能力检测：2 mL样品溶液与2 mL 0.1 mmol/mL的DPPH溶液充分混匀，避光静置30 min后检测其在517 nm波长处的吸光度。羟自由基清楚能力检测：1 mL样品溶液与2 mL 6 mmol/L的FeSO4溶液、2 mL 6 mmol/L的H2O2溶液充分混匀后静置10 min，再向混合溶液中加入2 mL 6 mmol/L的水杨酸乙醇溶液，在50 ℃水浴30 min后检测其在510 nm波长处的吸光度。以等体积相同浓度抗坏血酸溶液代替样品溶液作为阳性对照。

3 结果

3.1 单因素试验

随着酶添加量的增大，莪术挥发油得率提高，当酶添加量达到1.5%时，得率为4.53%，再进一步添加纤维素酶，得率并没有显著变化，说明此时酶已达到饱和状态。故选择1.5%为最适酶添加量，见图1。

温度过高或过低，都不利于酶活性的发挥，纤维素酶辅助提取莪术挥发油的最适温度为50 ℃，此时得率达到最大值4.48%，见图2。

随着pH增大，莪术挥发油得率提高，当pH为4.8时，得率达到最大值4.76%，再进一步提高pH，得率反而减小。故选择pH 4.8为最佳酶解pH，见图3。

随着酶解时间的延长，莪术挥发油得率变大，当酶解时间为2.5 h时，得率达到4.26%，之后得率增幅很小，考虑到实际生产效率，故选择2.5 h为最佳酶解时间，见图4。

图4 酶解时间对莪术挥发油得率的影响

3.2 响应面试验

试验结果见表2，方差分析结果见表3。通过回归拟合，获得莪术挥发油得率（Y）与自变量（酶添加量、酶解pH、酶解时间）的二次多项回归方程：Y= -76.98+11.50A+34.93B-6.80C+0.75AB-0.18AC+4.04BC-4.51A2-4.88B2-2.65C2。回归方程模型P＜0.000 1，失拟项不显著（P=0.476 1），模型总决定系数R2=0.990 7，调整后Radj2=0.978 7，变异系数（C.V.）为3.03%，以上参数均说明该模型与试验数据拟合程度好，试验误差小，可用于不同变量条件下的响应值预测。三个因素对莪术挥发油酶法辅助提取的影响均非常显著（P＜0.01），其中酶解时间（C）影响最大，酶添加量（A）次之，酶解pH（B）影响最小。表3和图5结果表明，BC间交互作用对酶法辅助提取莪术挥发油的影响非常显著（P＜0.01），AB和AC间交互作用则对挥发油得率的影响不显著（P＞0.05）。

表2 响应面试验设计与结果

表3 方差分析结果

通过求解回归模型方程，得到莪术挥发油纤维素酶提取的最佳工艺：酶添加量1.6%、酶解pH 4.6、酶解时间2.1 h，在此条件下挥发油得率的理论值为5.29%。根据此工艺进行3次验证试验，获得的挥发油得率均值为5.24%±0.31%，与理论值相对误差为0.95%，说明回归模型有效可靠。纤维素酶辅助提取的挥发油得率显著高于单独水蒸气蒸馏法获得的得率2.17%±0.46%，纤维素酶辅助提取莪术挥发油工艺具有实际应用价值。

3.3 抗氧化活性

如图6和图7所示，莪术挥发油的DPPH自由基和羟自由基清除率均随着质量浓度的增加而明显增大，当挥发油质量浓度为1.2 mg/mL时，DPPH自由基清除率达到82.75%，羟自由基清除率为72.94%。莪术挥发油对DPPH自由基和羟自由基的半数抑制质量浓度分别为0.783和0.814 mg/mL。结果表明莪术挥发油对DPPH自由基和羟自由基均有一定的清除作用，但其体外抗氧化活性弱于抗坏血酸。

图6 莪术挥发油对DPPH自由基的清除作用

4 结论与讨论

研究通过单因素试验和响应面试验获得了纤维素酶辅助提取莪术挥发油的最佳工艺：酶添加量1.6%，酶解pH为4.6，酶解时间2.1 h，酶解温度50 ℃，料液比1∶10 mL/g。在此条件下获得的挥发油得率为5.24%，与理论预测值5.29%相对误差小于5%，说明回归模型有效可靠。纤维素酶辅助提取法的挥发油得率显著高于单纯水蒸气蒸馏法的得率2.17%。赵海燕等[4,9]分别使用微波、超声辅助提取法获得广西莪术挥发油的提取率，结果分别为5.18%和4.35%。蔡吉祥等[5]采用响应面试验对微波辅助提取蓬莪术油的工艺进行优化，获得的蓬莪术油得率为4.68%。罗莎等[10]研究发现超声波前处理-微波法提取温莪术的挥发油得率可达4.71%，高于超临界CO2萃取和水蒸气蒸馏法的4.47%和2.53%。祝冬青等[11]采用水蒸气蒸馏法获得莪术油的得率为2.40%。研究采用纤维素酶辅助提取，挥发油得率高于上述文献使用的方法，值得进一步研究推广。

研究表明，天然植物如花椒籽、落新妇挥发油对DPPH和羟自由基具有较强的清除活性，可作为潜在的天然抗氧化剂进行开发利用[12-13]。研究也发现，莪术挥发油对DPPH和羟自由基具有较强的清除作用，对DPPH和羟自由基的半数抑制质量浓度分别为0.783和0.814 mg/mL，这一点与前期文献结论一致[4,9]。研究通过优化莪术挥发油的纤维素酶辅助提取工艺，为莪术挥发油产品的进一步开发提供一定的理论基础，莪术挥发油的抗氧化活性研究，对于开发天然来源的美白化妆品、食品抗氧化剂和保鲜剂有一定的指导作用。