鱿鱼胴体分离蛋白的制备及营养成分分析

严鹏伟，张珊珊，蒲昕怡，包 斌,2，吴文惠,2*

（1.上海海洋大学 食品学院，上海 201306；2.舟山麦琳生物工程有限公司，浙江舟山 316100）

鱿鱼，又被称为枪乌贼、柔鱼，属于软体动物门，具有快速繁殖、成长所需时间短等特点[1]。鱿鱼具有高蛋白、低脂肪的特性，且鱿鱼富含丰富的氨基酸，不仅含有人体所需的必需氨基酸、牛磺酸等，还含有丰富的DHA、EPA 等高不饱和脂肪酸。鱿鱼中丰富的营养元素不仅提升了其营养价值，还促进了优质鱿鱼副产品的开发。鱿鱼肉质鲜嫩，味道可口，具有相当高的经济价值和食用价值，在当前海洋类产品中具有广阔的开发前景。鱿鱼是中国最重要的海产品之一，近年来我国鱿鱼的年捕捞量约30 万t，市场上常见的鱿鱼品种有秘鲁鱿鱼、阿根廷鱿鱼、太平洋鱿鱼等[2]。鱿鱼产业已经成为我国渔业资源中重要的组成部分。

鱿鱼胴体是鱿鱼最大的组成部分，其中蛋白质含量高，氨基酸种类丰富，是优质的蛋白来源。鱿鱼整体的粗蛋白含量较高，约占18%～20%。其中，肌浆蛋白的比例达到12%～20%，肌原纤维蛋白达到77%～85%，而基质蛋白约占2%～3%。当蛋白种类不同时，其中氨基酸的种类与含量也会发生变化，所以营养价值也有差异[3]。杨宪时等[4]分别对两种鱿鱼（日本海鱿鱼、秘鲁鱿鱼）胴体中的营养成分进行了分析和比较，结果表明日本海鱿鱼、秘鲁鱿鱼中蛋白质含量达到17.25%，并且两种鱿鱼中氨基酸种类达到18 种，其中必需氨基酸占总氨基酸的比例都超过了30%，氨基酸中谷氨酸含量最高，且谷氨酸参与人体脑组织的正常代谢，是人体中不可或缺的氨基酸成分；此外，对两种鱿鱼中必需氨基酸按照AAS 模式进行营养分析，分析评价均大于0.5，这表明两种鱿鱼胴体中氨基酸含量丰富均衡，符合人体氨基酸需求。JAZAYERI 等[5]对波斯湾鱿鱼与泰国鱿鱼的蛋白质含量进行了检测，结果表明前者含有17%的蛋白质，泰国鱿鱼中含有14.91%的蛋白质，地区间的差异可能会对鱿鱼的营养成分造成影响。

鱿鱼蛋白含量高、氨基酸种类丰富的特点，提高了鱿鱼的生物价值。吴莉敏等[6]研究发现在鱿鱼内脏的消化液中含有多种氨基酸，如缬氨酸、蛋氨酸及呈味氨基酸等，可制备成风味独特、高营养价值的海鲜酱油；此外，内脏消化液中还具有甘氨酸、谷氨酸等含量较高的氨基酸，这类氨基酸具有促进草虾进食饵料的作用，可用于开发虾类饲料。管雪娇等[7]研究发现秘鲁鱿鱼皮中的蛋白含量高，氨基酸种类达到17 种，而且脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸是其特征氨基酸，可用于开发胶原蛋白。鱿鱼皮胶原蛋白内包含了羟脯氨酸、精氨酸、甘氨酸、脯氨酸，是I 型胶原蛋白，这使得其具备了比较低的过敏性，并且容易被酶解，研究利用价值较高。本研究以阿根廷鱿鱼、巴特柔鱼、太平洋鱿鱼胴体为原料，使用碱提酸沉的方法从鱿鱼胴体中提取分离蛋白，通过真空冷冻干燥的方式制备分离蛋白粉末，并对制备的鱿鱼胴体分离蛋白的功能特性与营养价值进行分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

主要材料与试剂如表1 所示。

1.2 仪器设备

主要实验仪器如表2 所示。

表2 主要实验仪器

1.3 实验方法

1.3.1 鱿鱼胴体分离蛋白的制备

冷冻鱿鱼浸泡在清水中，常温下解冻，解冻后使用清水冲洗干净。切除鱿鱼的头、足等部位，剥除鱿鱼表层的薄膜及鱿鱼皮，抽除鱿鱼胴体中的骨架，使用清水冲洗几遍，去除胴体表面的杂质。鱿鱼胴体称重，按照料液比1 ∶3 分别加入清理好的鱿鱼胴体和浓度为0.1 mol·L-1的NaOH 水溶液，混合放置7 h。倒去溶液，使用清水将鱿鱼胴体表面冲洗干净，先用刀将鱿鱼切成较小的块状，再使用破壁机将鱿鱼块处理至肉糜状态。按照料液比1 ∶3添加浓度为0.1 mol·L-1的NaOH 水溶液，使用均质机均质至匀浆状态，均质后的混合液使用高速冷冻离心机离心，离心机转速为8 000 g、离心25 min。离心后倒出上清液，使用6 mol·L-1的HCl 调节上清液pH 至5.5 左右。设置相同的离心条件，再次离心，收集沉淀，此时沉淀即为分离粗蛋白。鱿鱼胴体粗蛋白保存在-80 冰箱中，经过真空干燥后可获得鱿鱼胴体粗蛋白粉末。

1.3.2 SDS-PAGE 电泳分析

为了解提取出的鱿鱼胴体粗蛋白的蛋白质组成情况，使用SDS-PAGE 电泳实验分析其分离蛋白。本次实验在LAEMMLI[8]的实验方法基础上稍作修改，配制0.1 mol·L-1的醋酸溶液，添加鱿鱼胴体分离蛋白，调节蛋白浓度在1 mg·mL-1，向样品中加入凝胶上样缓冲液，混合均匀，沸水浴8 min，离心后吸取清液，上样量为10 µL。

实验中保持电压恒定，前期保持80 V 的电压，观察到样品至分离胶后，增高电压至120 V。电泳结束后，使用考马斯亮蓝R-250 染色，染色时间1 h，每次脱色1 h，重复脱色，当胶的背景为无色时，即表示脱色完全，脱色结束后进行拍照。

1.3.3 鱿鱼胴体分离蛋白氨基酸组成的测定

鱿鱼胴体粗蛋白的氨基酸成分测定使用高效液相的方法进行测定，测定包含常见的16 种氨基酸及色氨酸。称取24.7 g 鱿鱼胴体分离蛋白至反应瓶中，加入1 mL 6 mol·L-1盐酸，110 酸解24 h。取200 µL液体，加入100 µL 2 mol·L-1NaOH 中和，涡旋混匀，用AccQ·Tag Ultra Borate 缓冲液稀释90 倍。取10 µL样品到瓶中，加入70 µL AccQ·Tag Ultra Borate 缓冲液和20 µL AccQ·Tag 试剂。将反应混合物在55 加热10 min，冷却后上机测定；另取样用6 mol·L-1氢氧化钠水解后按照上述过程同机测定[9-10]。

1.3.4 液相色谱参数

色谱柱：Waters BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 µm）；流动相：A 相为超纯水（含0.1%甲酸），B 相为乙腈（含0.1%甲酸）；开启电脑、泵等装置，打开色谱软件，流速设置为0.5 mL·min-1，柱温为55 ，进样量为1 µL。

1.3.5 鱿鱼胴体分离蛋白基本成分测定

灰分测定参考GB/T 5009.4—2016，采用灼烧法；粗蛋白测定的方法是称取0.5 g 的鱿鱼胴体分离蛋白粉末，加入0.4 g 硫酸铜、6 g 硫酸钾及20 mL 硫酸于消化炉中消化，当消化炉温度达到420 ，继续消化2 h，调节凯氏定氮仪，测定其含量。

1.3.6 鱿鱼胴体分离蛋白溶解度测定

阿根廷鱿鱼、巴特柔鱼、太平洋鱿鱼胴体分离蛋白溶解性的测定依据SANCHEZ-ALONSO 等的法[11]，并稍作修改。分别取鱿鱼胴体分离蛋白加入蒸馏水，配制成7 份，使用浓度为0.5 mol·L-1的NaOH、HCl 溶液，调节其中6 份溶液的pH，pH 梯度分别为2、4、6、8、10、12，剩余的一份为初始样液，分别取各溶液1 mL，加入蛋白粉末1 mg。将7 份蛋白溶液涡旋5 min，离心15 min，离心后吸取清液，使用BCA 试剂盒法检测。上清液中蛋白浓度占离心前总蛋白浓度的比值即为蛋白溶解度。

2 结果与分析

2.1 鱿鱼胴体分离蛋白的SDS-PAGE 电泳分析

鱿鱼中蛋白质含量丰富，粗蛋白占比接近20%。其中肌原纤维蛋白的含量约占总蛋白含量的77%～85%，主要包括肌球蛋白重链（Myosin Heavy Chain，MHC）、肌动蛋白（Actin，AC）、原肌球蛋白（Tromyosin，TM）以及软体动物中含有的副肌球蛋白（Paramyosin，PM）[12]。

由图1 可知，3 种鱿鱼蛋白的分子量主要分布在190 ～280 kDa、95 kDa、50 kDa、45 kDa、36 kDa，其中190～280 kDa蛋白是鱿鱼肌球蛋白重链（MHC），约95 kDa 的蛋白是副肌球蛋白（PM），约45 kDa 的蛋白是肌动蛋白（AC），分子量较小的蛋白是原肌球蛋白（TM），约36 kDa[13]。在3 种鱿鱼胴体分离蛋白的SDS-PAGE 电泳分析结果中，巴特柔鱼和太平洋鱿鱼中MHC 条带颜色较深，且条带较宽，表示这部分蛋白相近分子质量较多，含量较高，出现较模糊的条带。阿根廷鱿鱼胴体分离蛋白的MHC 条带颜色较浅，说明在酸性条件下，MHC 发生了一些降解[14]，但其条带与另外两种鱿鱼蛋白的条带相比，条带颜色的深浅与带宽的差异并不是十分明显。根据分离蛋白的电泳图可以看出，鱿鱼胴体分离蛋白没有因为酸碱的处理，而导致大分子蛋白的明显聚集和降解。

图1 不同鱿鱼胴体分离蛋白电泳图

2.2 鱿鱼胴体分离蛋白氨基酸组成分析

对阿根廷鱿鱼、巴特柔鱼、太平洋鱿鱼胴体分离蛋白中的氨基酸的种类及含量进行了测定，结果如表3 所示。测定的17 种氨基酸中，阿根廷鱿鱼、巴特柔鱼、太平洋鱿鱼胴体蛋白中的亮氨酸与赖氨酸在成人人体必需氨基酸中含量最高，其中亮氨酸分别为6.99 g/100 g、7.26 g/100 g、7.32 g/100 g，赖氨酸分别为7.07 g/100 g、7.56 g/100 g、7.25 g/100 g。经计算，其必需氨基酸占总氨基酸比例分别为43.64%、42.63%、42.00%，均达到世界卫生组织提出的优质蛋白质的标准[15]。3 种鱿鱼胴体分离蛋白的必需氨基酸与非必需氨基酸比值分别为77.45%、74.29%、72.42%，而根据FAO/WHO 的氨基酸标准模式[16]，当必需氨基酸占非必需氨基酸的比值在40%左右时，即表示蛋白质量较好，因此，研究制备的3 种鱿鱼蛋白均属于优质蛋白。

表3 不同鱿鱼胴体分离蛋白氨基酸组成

2.3 鱿鱼胴体分离蛋白基本成分分析

阿根廷鱿鱼、巴特柔鱼以及太平洋鱿鱼胴体分离蛋白经过冷冻干燥后制成粉末状，并对3 种鱿鱼胴体分离蛋白进行了灰分与粗蛋白的测定，结果如表2 ～表4 所示。结果表明，制备的3 种鱿鱼胴体分离蛋白中粗蛋白含量较高，都超过80%。该实验结果略低于董淑华[17]提取鸢乌贼分离蛋白中粗蛋白的含量，这可能是因为实验过程中未对蛋白进行透析，分离蛋白粉末中杂质较多[18]。此外，通过碱溶酸沉制得的蛋白样品中都含有较少的灰分，其灰分值低于1.85%。实验结果表明，经过碱溶酸沉方法制备的3 种鱿鱼胴体分离蛋白粉末中灰分含量与粗蛋白含量均比较接近，并且该方法提取出的鱿鱼胴体分离蛋白含量均较高，而灰分含量相对比较低。

表4 不同鱿鱼胴体分离蛋白的基本成分

2.4 鱿鱼胴体分离蛋白溶解度分析

由图2 可知，阿根廷鱿鱼、巴特柔鱼、太平洋鱿鱼胴体分离蛋白的溶解度随溶液pH 的变化而产生波动，3 种鱿鱼蛋白的溶解情况整体上相似，趋势大致呈现为U 型的形式。当溶液pH 接近中性范围时，3 种鱿鱼蛋白的溶解度都非常低，尤其是pH 在6 ～7 时，其溶解度最低，这可能是由于溶液pH 范围比较接近胴体分离蛋白的等电点，蛋白质不易溶解。伴随溶液pH 发生变化，逐渐偏离中性范围时，3 种鱿鱼蛋白溶解度逐渐升高，当溶液pH 分别为2、12 时，3 种蛋白的溶解度均达到极高的位置，并且数值比较接近，这可能是由于溶液酸碱性在2 和12 两种环境下，蛋白中的分子发生解离，且蛋白的二级结构出现转变，对蛋白的电荷与侧链基团产生影响[19]。此外，在溶液pH 为2时，3 种鱿鱼蛋白均达到比较高的溶解度，而人体的胃酸环境pH 大致在2 左右，因此，如果基于分离蛋白酸性环境溶解情况良好的性质将其应用到食品中，那食品中添加的分离蛋白可能会更易于人体吸收和利用[20]。

图2 不同鱿鱼胴体分离蛋白溶解度

3 结论

研究选择使用碱溶酸沉的方法制备阿根廷鱿鱼、巴特柔鱼、太平洋鱿鱼胴体分离蛋白，本研究对制备的3 种鱿鱼胴体分离蛋白的基本成分及营养成分进行了分析。从3 种分离蛋白的氨基酸分析结果可以发现，3 种鱿鱼蛋白都含有丰富的氨基酸，包括了17 种氨基酸类型，其中必需氨基酸与总氨基酸的比例均超过40%，表明该蛋白质为优质蛋白。研究对提取得到的鱿鱼胴体分离蛋白的溶解度进行检测，3 种鱿鱼胴体分离蛋白的溶解性受到pH 变化而产生波动，3 种蛋白溶解性主体上表现为U 型的趋势，其中pH 值在2、4、11、12 时溶解性均较好，但pH 值接近中性范围时，蛋白的溶解性最差。本研究中制取得到3 种分离蛋白粉末，SDS-PAGE电泳结果表明，3 种蛋白的分子条带都比较清晰，条带中没有出现明显的聚集或降解的现象。通过对3 种鱿鱼蛋白粉的基本成分分析来看，3 种鱿鱼蛋白中灰分含量均低于1.89%，而粗蛋白含量都不低于80%。综上，本研究对3 种鱿鱼胴体分离蛋白的基本成分及营养成分做了检测分析，研究发现鱿鱼胴体分离蛋白中氨基酸配比合理，且富含多种人体必需氨基酸，表明鱿鱼蛋白是一种优质的蛋白资源，为鱿鱼蛋白在食品等领域的深入研究提供了理论依据。